黃英，楊明華，畢保良，潘洪彬，俞政全，高士爭，李永能，趙素梅

云南農(nóng)業(yè)大學 a.云南省動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室；b.科技管理處；c.招生就業(yè)處；云南 昆明 650201

隨著經(jīng)濟的快速發(fā)展和生活水平的不斷提高，肥胖已成為現(xiàn)代社會最常見的營養(yǎng)障礙性疾病之一，肥胖患病率呈現(xiàn)明顯上升的趨勢。肥胖可導致心血管疾病、高血壓、2型糖尿病和某些癌癥，從而增加死亡風險[1]。隨著對肥胖發(fā)生在基因水平上的深入研究，與肥胖相關(guān)的肥胖易感基因——脂肪和肥胖相關(guān)基因（fat mass and obesity associated gene，F(xiàn)TO基因）受到人們的關(guān)注。豬具有與人類相似的器官構(gòu)成和代謝類型，尤其是在脂肪代謝和沉積方面，是研究人類肥胖的最佳模型。然而，豬FTO基因的相關(guān)研究十分欠缺，對烏金豬FTO基因的研究未見報道。烏金豬是云南省地方豬種之一，具有耐粗飼、適應(yīng)性強、腹部脂肪沉積較多等性狀特點，是研究人類肥胖疾病機理的理想動物模型。

我們采用反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)，從烏金豬脂肪組織中克隆FTO基因，并對該基因的序列結(jié)構(gòu)和特征進行了生物信息學分析，同時通過軟件對該蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)進行了預(yù)測，構(gòu)建其分子系統(tǒng)進化樹，并采用實時PCR方法對7種組織進行了組織表達譜分析，為深入研究烏金豬FTO基因的生物學功能奠定了重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

屠宰成年烏金豬3頭，取所需各種組織樣本，液氮速凍，-80℃保存。TRIzol-A+試劑購于北京天根生化科技有限公司；EasyScript第一鏈cDNA合成試劑盒購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；pMD18-T載體、DL2000 DNA marker等均購于大連寶生物工程有限公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 RNA提取

用TRIzol-A+試劑提取1頭烏金豬脂肪組織總RNA，用核酸蛋白定量儀測定RNA的濃度及純度，D260nm/D280nm=1.8～2.0，并經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性后備用。

1.3 PCR引物設(shè)計及PCR反應(yīng)條件優(yōu)化

根據(jù)GenBank中公布的豬的相應(yīng)基因序列（登錄號：NM_001112692.1），用Primer Primer 5.0軟件針對該基因設(shè)計2對引物，一對用于FTO基因的克隆，另一對用于FTO基因多組織的實時PCR，并以18S rRNA看家基因為內(nèi)參。引物序列見表1，由生工生物工程（上海）有限公司合成。

FTO基因克隆PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性 40 s，58℃退火 40 s，72℃延伸 30 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。用ddH2O代替反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為空白對照，用以檢驗是否有外源基因和基因組DNA污染。

1.4 cDNA合成與基因克隆

從1頭烏金豬脂肪組織中提取總RNA，根據(jù)所測定的濃度，各取2 μg總RNA進行反轉(zhuǎn)錄，用Ea?syScript第一鏈cDNA合成試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄（42℃反轉(zhuǎn)錄30 min，85℃加熱5 min以使反轉(zhuǎn)錄酶失活），反應(yīng)體系為20 μL。反轉(zhuǎn)錄后的cDNA單鏈可于-20℃保存或立即用于PCR。用生工生物工程（上海）有限公司的膠回收試劑盒回收PCR擴增的目的片段，并將其連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌，涂布LB培養(yǎng)基平板，長出菌落后經(jīng)藍白斑篩選挑取白色單菌落，于LB培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)12 h左右，分別取PCR鑒定過的菌液提取重組質(zhì)粒，用KpnⅠ/HindⅢ雙酶切鑒定，將鑒定過的菌液及質(zhì)粒送生工生物工程（上海）有限公司進行DNA序列測定。

1.5 生物信息學分析

將反轉(zhuǎn)錄PCR所得基因片段測序后，用DNA?Star 6.0軟件包中的Seqman程序進行序列拼接，用BLAST工具和DNAStar 6.0軟件包進行序列同源性比對和cDNA序列分析，用Meg4軟件進行系統(tǒng)進化樹分析；利用 ExPASy、SignalP、ProtScale、NetPhos、NetNGlyc、TMHMM、SMART、PSIPRED 和 SWISSMODEL網(wǎng)站在線程序?qū)TO蛋白的等電點、相對分子質(zhì)量、信號肽、疏水性輪廓、磷酸化位點、糖基化位點、跨膜信息、二級結(jié)構(gòu)及三級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測。所用相關(guān)分析軟件的生物信息學網(wǎng)址見表2。

1.6 實時PCR分析組織表達譜

分別提取3頭烏金豬心、肝、脾、肺、腎、肌肉和脂肪等7種組織的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以FTO F2/R2為引物進行實時PCR。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個循環(huán)；72℃延伸10 min。18S rRNA和FTO基因熒光定量PCR反應(yīng)條件只有退火溫度不同為55℃。每樣品3頭豬做3次重復，每個重復做2個平行，同時用ddH2O代替反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和熒光試劑作為空白對照，用以檢驗是否有外源基因和基因組DNA污染。將純化的目的基因或內(nèi)參基因的PCR產(chǎn)物進行1/10梯度稀釋后做標準曲線，共8個梯度濃度，每個濃度2個平行重復。相對表達量的分析以18S rRNA基因作為內(nèi)參基因，通過參照基因表達水平校正待測樣本中目標基因的相對表達量，然后將各樣品的Ct值與標準曲線進行比較，得出其起始模板拷貝數(shù)。

表1 PCR引物

表2 生物信息學軟件及網(wǎng)址

2 結(jié)果

2.1 烏金豬脂肪組織總RNA的提取

取3 μL提取的總RNA經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分離，結(jié)果見圖1，28S和18S條帶清晰，且28S和18S灰度比約為2∶1，無脫尾現(xiàn)象出現(xiàn)，點樣孔無殘留，表明RNA無降解，質(zhì)量可靠，可用于后續(xù)實驗。

圖1 烏金豬脂肪組織總RNA的瓊脂糖凝膠電泳

2.2 FTO基因的克隆

反轉(zhuǎn)錄PCR得到1518 bp的片段，經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，確認擴增產(chǎn)物與目的片段大小一致。將克隆的片段與pMD18-T載體連接，挑取陽性克隆，提取重組質(zhì)粒，用KpnⅠ/HindⅢ雙酶切鑒定，表明目的基因FTO已成功插入載體。見圖2。

2.3 烏金豬FTO基因序列及對應(yīng)蛋白

通過對PCR產(chǎn)物原液雙向測序及克隆后提取的陽性質(zhì)粒雙向測序，確定了1518 bp的編碼區(qū)（CDS）序列（已提交GenBank，登錄號為JQ031263），編碼由505個氨基酸殘基組成的蛋白（圖3）。

圖2 PCR擴增FTO基因（A）及重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定（B）

圖3 烏金豬FTO基因編碼區(qū)序列及對應(yīng)的氨基酸序列

2.4 生物信息學分析

2.4.1 同源性分析 用DNAMAN軟件將由FTO CDS推導的氨基酸序列與NCBI網(wǎng)站BLAST后下載的牛（登錄號：BC140478.1）、人（登錄號：NM_001080432.2）、羊（登錄號：EU072419.1）和大鼠（登錄號：BC168239.1）等4個物種的FTO CDS編碼的氨基酸序列進行比對，同源性分別為91%、89%、90%和83%（圖4）。

2.4.2 等電點與相對分子質(zhì)量預(yù)測 利用ExPASy網(wǎng)站在線工具預(yù)測的FTO蛋白的理論等電點為5.18，相對分子質(zhì)量為58.16×103。

2.4.3 進化樹分析 用Meg4軟件構(gòu)建烏金豬、牛、人、羊和大鼠FTO蛋白的系統(tǒng)進化樹，結(jié)果顯示烏金豬與牛、羊的親緣性較近，其次是人、大鼠（圖5）。

2.4.4 FTO蛋白的特征分析 用TMHMM程序預(yù)測FTO蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該蛋白無跨膜區(qū)，表明該蛋白不是跨膜蛋白；用SignalP 3.0 Server軟件分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白無信號肽出現(xiàn)；用NetPhos 2.0 Server對蛋白序列的磷酸化位點進行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)烏金豬FTO蛋白結(jié)構(gòu)中的磷酸化修飾位點共22個，包括10個絲氨酸蛋白激酶磷酸化位點、7個蘇氨酸蛋白激酶磷酸化位點、5個酪氨酸蛋白激酶磷酸化位點（圖6）；用NetNGlyc 1.0 Server對FTO蛋白的糖基化位點進行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)在200、246、302位氨基酸殘基處有糖基化位點（圖7）；用網(wǎng)上在線工具ExPASy-ProtScale預(yù)測FTO蛋白的疏水性，發(fā)現(xiàn)該蛋白的疏水性最大值為3.056，最小值為-3.222，表明該蛋白是一個親水性蛋白（圖8）。

圖4 人（Homo）、大鼠（Rattus）、牛（Bos）、羊（Ovis）和烏金豬FTO CDS編碼的氨基酸序列的同源性比較

圖5 人、大鼠、牛、羊和烏金豬的FTO進化樹

2.4.5 FTO蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu) 用PSIPRED程序預(yù)測該蛋白的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明共有201個螺旋（helix）、33個伸展鏈（strand）和271個卷曲結(jié)構(gòu)（coil）（圖9）。用網(wǎng)上在線工具SWISSMODEL分析了該蛋白的三級結(jié)構(gòu)（圖10）。

圖6 FTO蛋白的磷酸化位點預(yù)測

圖7 FTO基因的糖基化位點預(yù)測

圖8 FTO蛋白的疏水性預(yù)測

圖9 FTO蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.5 FTO基因的組織表達譜

用FTO F2/R2引物分別擴增了3頭烏金豬的7種組織的cDNA，實時PCR結(jié)果表明，F(xiàn)TO基因mRNA在肝臟組織中的表達最高，在腎、脂肪、肺和脾組織中也大量表達，在心臟和肌肉組織中少量表達（圖11）。

3 討論

1999年，一篇關(guān)于腳趾融合小鼠的文獻對FTO基因進行了報道[2]，但隨后的研究進展緩慢，直至2007年發(fā)現(xiàn)人的該基因與肥胖有關(guān)，才逐漸成為研究熱點。FTO基因是一個與肥胖相關(guān)的等位基因[3]，屬于非血紅色加雙氧酶基因超家族，編碼2-酮戊二酸依賴的核酸脫甲基酶[4-5]。FTO廣泛存在于脊椎動物和海洋藻類中，是一個攜帶核定位信號的球狀蛋白。FTO基因mRNA在人、鼠大多數(shù)組織中均有表達，尤其在下丘腦中表達豐富[4,6]。本研究表明，F(xiàn)TO基因mRNA在烏金豬7個組織中的表達量有差異，在肝組織中表達量最高，脂肪、腎、脾中也有大量表達，心臟、肌肉中表達量最少。Frayling等用實時PCR發(fā)現(xiàn)FTO基因編碼蛋白在人體組織中廣泛分布，包括脂肪組織、胰島β細胞、垂體、腎上腺、大腦，尤其是在下丘腦弓狀核中高表達[3-4]。郭兵等研究表明，梅山豬FTO基因在海馬、脂肪、肝臟和肌肉組織中均有表達，在海馬中的表達量最高，在脂肪和肝臟組織中表達量較高，肌肉組織中的表達量較少[7]。

圖10 FTO蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

我們克隆了烏金豬FTO基因編碼區(qū)全長系列，并和人、牛、羊和鼠等4個物種進行了進化樹分析，表明烏金豬FTO與牛、羊的親緣性較近，其次是人、大鼠。

圖11 烏金豬FTO基因的組織表達譜

生物信息學是通過數(shù)學、統(tǒng)計學和計算機科學等學科對生物數(shù)據(jù)進行分析的方法和技術(shù)，由于它快速、高效和低成本，已被廣泛用于預(yù)測蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能和其他生物學特征[8]。蛋白質(zhì)分析一般包括信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)和磷酸化位點、二級結(jié)構(gòu)等的分析。蛋白質(zhì)磷酸化是最常見、最重要的一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式[9]，它參與和調(diào)控生物體內(nèi)的許多生命活動，如信號轉(zhuǎn)導、基因表達、細胞周期調(diào)控等諸多細胞過程[10]。蛋白質(zhì)磷酸化位點主要發(fā)生在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基上[11]。本研究表明烏金豬FTO蛋白結(jié)構(gòu)中的磷酸化修飾位點共22個，這些磷酸化位點將是調(diào)控FTO蛋白功能的關(guān)鍵位點。糖基化是真核生物蛋白質(zhì)翻譯后重要的修飾之一，有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能的作用[12]，我們推測的烏金豬FTO氨基酸序列在200、246、302位有糖基化位點。從氨基酸序列到蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，是理解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的重要一步，對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測有助于了解其三維構(gòu)象和分析其結(jié)構(gòu)域[13]。本研究結(jié)果表明，推測的烏金豬FTO氨基酸序列共有201個螺旋、33個伸展鏈和271個卷曲結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系密切，以上關(guān)于FTO推測的氨基酸序列分析將為其蛋白質(zhì)的生物學功能研究提供理論依據(jù)。

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