曲洺逸，王靜雪，王思涵 ，房芳，陳琳，張文成，賈雅麗，岳文，謝小燕，裴雪濤

1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 野戰(zhàn)輸血研究所干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)研究室，北京 100850；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 華南干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)研究中心，廣東 廣州 510005；3.全軍干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100850

大劑量化療和造血干細(xì)胞移植術(shù)后以及大量失血等引起的血小板減少可能危及生命，目前，臨床多采用輸注他人捐獻(xiàn)的血小板進(jìn)行治療。但血小板輸注不僅存在擴(kuò)散某些血液傳播疾病的可能，同時(shí)由于血小板易于激活的自身特點(diǎn)，貯存條件要求苛刻，儲(chǔ)存時(shí)間短，使得當(dāng)前機(jī)采血小板供應(yīng)持續(xù)緊張[1]，因此人們將目光投向了在體外生產(chǎn)血小板替代物。我們和其他實(shí)驗(yàn)室的相關(guān)研究表明，體外誘導(dǎo)的巨核系祖細(xì)胞可以成為血小板的有效替代品，輸注巨核系祖細(xì)胞不僅安全可行，還可以有效恢復(fù)血小板數(shù)量[2-4]。骨髓、臍帶血和外周血來源的造血干細(xì)胞都可以產(chǎn)生有功能的血小板或巨核系細(xì)胞[5-7]，由于臍帶血具有來源豐富、采集方便的特點(diǎn)，已成為獲取造血干細(xì)胞的主要來源。

巨核細(xì)胞的誘導(dǎo)分化一般通過模擬體內(nèi)微環(huán)境實(shí)現(xiàn)，而骨髓是成年人體內(nèi)主要的巨核分化場所，它主要是由造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞，以及這2種干細(xì)胞的分化產(chǎn)物共同組成的[8]。其中間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC）是造血微環(huán)境中重要的基質(zhì)細(xì)胞，一方面它作為間充質(zhì)組織的前體細(xì)胞，參與形成造血微環(huán)境，為造血干細(xì)胞提供結(jié)構(gòu)支撐，發(fā)揮著支持造血的作用；另一方面，通過細(xì)胞本身及分泌的基質(zhì)蛋白與造血干細(xì)胞的細(xì)胞間接觸作用，以及向微環(huán)境釋放造血相關(guān)細(xì)胞因子的旁分泌作用于造血干細(xì)胞兩種方式，實(shí)現(xiàn)對造血功能的精細(xì)調(diào)控[9]。MSC是一群混雜的多能干細(xì)胞，可以從人的某些組織中分離出來，并在體外進(jìn)行培養(yǎng)后應(yīng)用于臨床，在異體造血干細(xì)胞移植的過程中，MSC的應(yīng)用有利于受者的造血重建，對于造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的恢復(fù)都顯示出了很好的治療作用[10-11]。但是，MSC對于造血干細(xì)胞向巨核系分化并最終生成血小板的作用仍然存在爭議。一些人認(rèn)為，大量基質(zhì)細(xì)胞維持了造血微環(huán)境的穩(wěn)定狀態(tài)，在維持造血干細(xì)胞數(shù)量的同時(shí)阻止其分化，從而阻礙了巨核細(xì)胞及血小板的生成[12-13]。而另一些人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果卻顯示了相反的結(jié)果。MSC表達(dá)TPO、IL-3、IL-6等巨核分化過程中的主要造血調(diào)控因子和生長因子，刺激巨核細(xì)胞生長和成熟，并且黏附在MSC旁的造血集落常高表達(dá)CD41等巨核表面標(biāo)志。直接將MSC和造血干細(xì)胞共培養(yǎng)，或在誘導(dǎo)體系內(nèi)加入MSC的條件培養(yǎng)基，都能夠促進(jìn)造血干細(xì)胞向巨核分化和最終形成血小板[14]。

為確定MSC對造血干/祖細(xì)胞分化為巨核細(xì)胞的影響，從而進(jìn)一步優(yōu)化造血干細(xì)胞向巨核細(xì)胞的誘導(dǎo)分化體系，我們對MSC和臍帶血來源的單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行了共培養(yǎng)。由于不同MSC分泌的造血因子不同[15]，對造血干細(xì)胞各系分化的影響也不盡相同[16]。因此，我們分別嘗試了人骨髓和臍帶2種來源的MSC與臍帶血中分離的單個(gè)核細(xì)胞的共培養(yǎng)，觀察MSC對造血干細(xì)胞向巨核細(xì)胞分化產(chǎn)生的影響。并通過比較這2種MSC中造血因子相關(guān)基因的表達(dá)水平，對它們作用于巨核分化和增殖的效果做了進(jìn)一步分析，并用Trans-well分隔MSC和造血干細(xì)胞，對MSC通過旁分泌作用促進(jìn)巨核分化和增殖做了進(jìn)一步的驗(yàn)證。

1 材料和方法

1.1 材料

篩選足月妊娠健康產(chǎn)婦，經(jīng)受試者知情同意后，于產(chǎn)房無菌條件下采集臍帶及臍帶靜脈血；人外周血淋巴細(xì)胞分離液來自天津?yàn)柹镏破房萍加邢薰荆籜vivo15無血清培養(yǎng)基購自LONZA公司；α-MEM培養(yǎng)基購自GIBCO公司；胎牛血清購自Hy?clone公司；堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）、重組人血小板生成素（TPO）、干細(xì)胞生長因子（SCF）、白細(xì)胞介素3（IL-3）、IL-6、IL-11購自Peprotech公司；CD41a-FITC、CD-61-APC和CD34-PE抗體購自eBioscience公司；CD29-PE、CD31-APC、CD45-PE、CD73-PE、CD90-PE、CD105-FITC和CD166-PE抗體購自BD公司；Von Kossa染色試劑盒購自Genmed Scientifics公司；瑞氏吉姆薩染色液購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。

1.2 臍血單個(gè)核細(xì)胞的分離

新鮮臍帶血與6%羥乙基淀粉按4∶1混合后搖勻，室溫靜置30～50 min，待紅細(xì)胞沉降至界限分明后收集上層清液，1800 r/min離心7 min，收集細(xì)胞，再用人淋巴細(xì)胞分離液分離出單個(gè)核細(xì)胞。

1.3 MSC的分離培養(yǎng)

臍帶MSC和骨髓MSC分別采取機(jī)械分離法和全骨髓培養(yǎng)法分離獲得。在α-MEM培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清和1 U/mL bFGF配制成完全培養(yǎng)基用于培養(yǎng)細(xì)胞，每2 d換液。將4×104MSC接種于含500 μL完全培養(yǎng)基的24孔板中，24 h后，當(dāng)培養(yǎng)孔中的貼壁細(xì)胞滿度約80%時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4 臍血單個(gè)核細(xì)胞的誘導(dǎo)分化

巨核細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基為含TPO 100 ng/mL、SCF 50 ng/mL、IL-3 20 ng/mL、IL-6 50 ng/mL、IL-11 20 ng/mL的Xvivo15無血清培養(yǎng)基。將5×105單個(gè)核細(xì)胞接種于含500 μL完全培養(yǎng)基的24孔板中，48 h半量換液。

1.5 細(xì)胞增殖情況及形態(tài)觀察

在一定時(shí)間點(diǎn)，將孔內(nèi)懸浮細(xì)胞輕柔吹打成單細(xì)胞懸液，并用臺盼藍(lán)染色，計(jì)數(shù)存活細(xì)胞。將適宜密度的細(xì)胞置于細(xì)胞涂片機(jī)上樣孔中，2000 r/min離心2 min后進(jìn)行吉姆薩染色，干燥后于顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 MSC的誘導(dǎo)分化

成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基為α-MEM培養(yǎng)基，含10%胎牛血清、1 μmol/L 地塞米松、10 mmol/L胰島素、0.5 mmol/L IBMX、200 μmol/L吲哚美辛。每3～4 d換液，誘導(dǎo)14 d后油紅O染色鑒定。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基為α-MEM培養(yǎng)基，含10%胎牛血清、50 μmol/L維生素 C、0.1 μmol/L 地塞米松、10 mmol/L β-磷酸甘油，每3～4 d換液，誘導(dǎo)21 d，Von Kossa染色鑒定。

1.7 MSC和單個(gè)核細(xì)胞共培養(yǎng)

將4×104MSC接種于含500 μL完全培養(yǎng)基的24孔板中，24 h后，當(dāng)培養(yǎng)孔中的貼壁細(xì)胞滿度約80%時(shí)，用PBS沖洗3次，按照分組，將單個(gè)核細(xì)胞懸液直接加入MSC上或Trans-well上共培養(yǎng)。

1.8 細(xì)胞表面標(biāo)志的檢測

將消化后的MSC、處于誘導(dǎo)分化不同時(shí)間點(diǎn)的單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行離心洗滌，之后將約5×105細(xì)胞重懸于100 μL PBS中，根據(jù)抗體使用說明添加相應(yīng)抗體，充分混勻細(xì)胞與抗體，并將離心管置于旋轉(zhuǎn)混合儀上進(jìn)行流式抗體孵育，4℃避光標(biāo)記40 min，之后重復(fù)洗滌細(xì)胞3次，用300 μL PBS重懸細(xì)胞，BD流式細(xì)胞儀檢測表面標(biāo)志的表達(dá)并分析。

1.9 實(shí)時(shí)定量PCR檢測mRNA表達(dá)水平

用TRIzol提取臍帶和骨髓MSC總RNA，各取0.8 μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到相應(yīng)的cDNA，采用SYBR Green法實(shí)時(shí)定量PCR檢測相關(guān)基因的表達(dá)，所用引物序列見表1。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以x±s表示，用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 建立臍帶血造血干/祖細(xì)胞向巨核細(xì)胞的誘導(dǎo)分化體系

在Xvivo15和細(xì)胞因子的混合培養(yǎng)體系中，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，細(xì)胞數(shù)量增多，逐漸成熟。收集誘導(dǎo)不同天數(shù)的單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行流式分析，在1 mL培養(yǎng)體系中，培養(yǎng)前單個(gè)核細(xì)胞中的CD41a和CD61雙陽性細(xì)胞數(shù)為（0.253±0.0814）×106個(gè)；在巨核細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，隨著時(shí)間推移，培養(yǎng)細(xì)胞中得到的CD41a和CD61雙陽性細(xì)胞數(shù)和陽性比例都明顯增加，在3 d時(shí)得到的CD41a和CD61雙陽性細(xì)胞為（1.348±0.224）×106個(gè)，6 d時(shí)為（2.825±0.267）×106個(gè)，擴(kuò)增了14倍（圖1A）。在誘導(dǎo)培養(yǎng)的第0～6 d，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，CD41a、CD61的表達(dá)陽性率逐漸增加，6 d時(shí)達(dá)最高，CD41a+細(xì)胞比例可達(dá)70%左右，CD41a和CD61雙陽性比例可達(dá)35%（圖1C）。瑞氏吉姆薩染色后進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，可見不同階段的巨核系祖細(xì)胞形態(tài)，誘導(dǎo)6 d后細(xì)胞體積明顯增大，并出現(xiàn)了大量多核細(xì)胞，細(xì)胞核增大，形狀不規(guī)則，多呈分葉狀或多葉扭轉(zhuǎn)狀（圖1B）。Q-PCR結(jié)果顯示巨核相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子GATA-1、GATA-2和巨核特異基因CD41、CD61的mRNA表達(dá)量與第0 d相比增加明顯（圖1D）。

2.2 臍帶和骨髓MSC的分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增、誘導(dǎo)分化與表型分析

形態(tài)學(xué)觀察，臍帶和骨髓MSC形態(tài)相似，為形態(tài)相對均一的長梭形，細(xì)胞貼壁呈平行排列生長或旋渦狀生長，細(xì)胞折光性較好，核仁明顯，胞體較寬。細(xì)胞可培養(yǎng)20代以上，在體外均能分化為脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞。2種MSC培養(yǎng)至第5代時(shí)進(jìn)行成骨和成脂誘導(dǎo)。MSC在成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液中培養(yǎng)1周，可觀察到細(xì)胞形態(tài)變圓，2周時(shí)細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)脂肪小滴，隨后脂滴逐漸增大、增多，3周時(shí)通過油紅O染色，脂滴被染成紅色；在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液中培養(yǎng)2周后，細(xì)胞胞體變寬，呈多邊形，4周后，經(jīng)Von Kossa染色，黑色顯示有鈣鹽沉積形成的結(jié)節(jié)，提示細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化（圖2A）。

表1 引物及序列

對第5代MSC進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測，發(fā)現(xiàn)骨髓和臍帶MSC均高表達(dá)CD29、CD90、CD166、CD105、CD73，不表達(dá)CD34、CD31、CD45（圖2B）。這說明骨髓、臍帶MSC雖然來源不同，但其表面標(biāo)志表達(dá)一致：兩者表達(dá)的表面標(biāo)志具有非單一性，高表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志CD90，間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志CD105、CD73，以及細(xì)胞黏附分子CD29和CD166；不表達(dá)造血前體細(xì)胞標(biāo)志CD34、白細(xì)胞抗原CD45，也不表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞表面抗原CD31，同時(shí)也說明我們分離得到的骨髓和臍帶MSC為非造血、非內(nèi)皮類細(xì)胞。

2.3 MSC與造血干/祖細(xì)胞接觸共培養(yǎng)對其向巨核細(xì)胞分化的影響

將從臍帶血中分離的單個(gè)核細(xì)胞直接接種于骨髓或臍帶MSC上，在巨核分化培養(yǎng)基中誘導(dǎo)3 d后在光鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)2種細(xì)胞生長狀態(tài)良好，且巨核細(xì)胞多黏附于MSC旁生長（圖3A）。實(shí)時(shí)定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，與骨髓或臍帶MSC共培養(yǎng)6 d后，懸浮細(xì)胞中一些巨核相關(guān)基因mRNA水平有所增加，特別是CD41、CD61、c-mpl這些巨核系標(biāo)志性基因的表達(dá)，共培養(yǎng)的2組都優(yōu)于空白對照組，其中與骨髓來源的MSC共培養(yǎng)的巨核細(xì)胞基因表達(dá)有相對顯著的變化（圖3B）。相對地，流式細(xì)胞術(shù)分析懸浮細(xì)胞分化情況顯示，對照無基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)體系，與MSC直接共培養(yǎng)對于促進(jìn)造血干細(xì)胞向巨核細(xì)胞分化的效果并不顯著。

圖1 臍帶血單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)體外誘導(dǎo)獲得巨核細(xì)胞的培養(yǎng)體系的建立

2.4 2種來源的MSC表達(dá)造血相關(guān)因子的檢測

圖2 骨髓和臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞多向分化能力和表面標(biāo)志的鑒定

相關(guān)研究表明，MSC可以表達(dá)多種造血因子，包括SCF、Flt3配體、TPO、LIF、G-CSF、GM-CSF、IL-3、IL-6等[17]。針對MSC對巨核細(xì)胞增殖分化的支持作用，我們在RNA水平分別檢測了臍帶和骨髓2種來源的MSC分泌表達(dá)巨核誘導(dǎo)相關(guān)因子的水平，結(jié)果均能檢測到TPO、IL-6、IL-7、LIF等促巨核系分化的造血因子的表達(dá)。其中TPO在2種間充質(zhì)細(xì)胞中沒有明顯差異，而IL-6、IL-7、SCF和LIF在骨髓來源的MSC中的表達(dá)量更高，GM-CSF在臍帶來源的MSC中的表達(dá)更高（圖4A）。

在所檢測的造血因子中，SCF表現(xiàn)出明顯的膜結(jié)合型和游離型2種形式，其中膜結(jié)合型SCF是造血微環(huán)境的重要組分，對造血干細(xì)胞增殖和髓系分化都發(fā)揮關(guān)鍵作用[18]。我們用RT-PCR檢測了SCF總量及各型的表達(dá)，經(jīng)過對條帶的灰度分析，發(fā)現(xiàn)骨髓MSCSCF的總量和游離型SCF均高于臍帶MSC，但膜結(jié)合型SCF在臍帶MSC中的表達(dá)更高（圖4B）。雖然MSC能夠分泌促進(jìn)巨核分化的相關(guān)造血因子，但2種MSC同造血干細(xì)胞直接共培養(yǎng)卻效果微弱，可能是某些如膜結(jié)合型SCF等基質(zhì)細(xì)胞膜蛋白通過直接接觸對巨核細(xì)胞成熟產(chǎn)生了抑制作用。

2.5 不同的共培養(yǎng)方式下MSC對造血干/祖細(xì)胞巨核分化的影響

我們設(shè)計(jì)了4種不同的共培養(yǎng)方式與非共培養(yǎng)組進(jìn)行比較（圖5A）：單個(gè)核細(xì)胞與臍帶MSC接觸共培養(yǎng)（UC）；單個(gè)核細(xì)胞與臍帶MSC非接觸共培養(yǎng)（UC+T）；單個(gè)核細(xì)胞與骨髓MSC接觸共培養(yǎng)（BM）；單個(gè)核細(xì)胞與骨髓MSC非接觸共培養(yǎng)（BM+T）；單個(gè)核細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)作為空白對照組（Control）?？瞻讓φ战M中不加入任何基質(zhì)細(xì)胞，用巨核細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)。

圖3 間充質(zhì)干細(xì)胞與單個(gè)核細(xì)胞直接共培養(yǎng)對造血干細(xì)胞向巨核細(xì)胞分化的影響

圖4 不同來源的間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)造血因子相關(guān)基因的RNA水平的檢測

經(jīng)過4 d的培養(yǎng)，巨核系特異性表面標(biāo)志CD41a和CD61的表達(dá)在2種來源的MSC的接觸培養(yǎng)組中與空白對照組相比并沒有明顯差異（P＞0.05）；非接觸培養(yǎng)時(shí)促分化效果顯著，其中骨髓非接觸培養(yǎng)組中CD41a和CD61雙陽性細(xì)胞比例為43.7%±1.73%，明顯高于臍帶非接觸培養(yǎng)為36%±1.66%，空白對照組低于上述兩組為27.3%±1.3%?？梢姽撬韬湍殠碓吹腗SC的旁分泌作用有促進(jìn)巨核分化的能力，但同造血干細(xì)胞直接接觸的情況下，這種作用的效果就極不明顯（圖5B）。細(xì)胞增殖分析顯示，懸浮細(xì)胞數(shù)在4個(gè)共培養(yǎng)組中都明顯增加，增長倍數(shù)為1.5～2，接觸和非接觸培養(yǎng)對總有核細(xì)胞數(shù)的影響沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但在2種不同培養(yǎng)方式中，骨髓來源的MSC均優(yōu)于臍帶來源的MSC，流式細(xì)胞術(shù)檢測表明各組造血前體細(xì)胞標(biāo)志CD34的表達(dá)沒有明顯差異（圖5C）。這說明，臍帶和骨髓來源的MSC均能夠在體外支持造血干/祖細(xì)胞的擴(kuò)增并輔助巨核誘導(dǎo)體系促進(jìn)巨核系細(xì)胞分化，其中本研究使用的臍帶來源的MSC對于造血干/祖細(xì)胞及巨核祖細(xì)胞的支持能力弱于骨髓來源的，并且這種支持作用的差異不論與造血細(xì)胞接觸與否都能體現(xiàn)，可能是由骨髓細(xì)胞分泌更適合巨核分化的生長因子所致。

3 討論

圖5 5種培養(yǎng)體系對造血干/祖細(xì)胞向巨核細(xì)胞分化以及分化過程中對細(xì)胞增殖的影響

目前臨床上血小板供應(yīng)緊張，如何在體外獲得大量成熟的巨核細(xì)胞成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。然而巨核分化是一個(gè)復(fù)雜的過程，須經(jīng)歷造血干細(xì)胞向巨核系的分化、巨核祖細(xì)胞的擴(kuò)增，再進(jìn)行核內(nèi)染色體的復(fù)制，形成多核的能產(chǎn)生血小板的血小板前體細(xì)胞[19]。這個(gè)過程受造血微環(huán)境及各種正負(fù)調(diào)控因子的影響。MSC雖然在造血微環(huán)境中數(shù)量不多，但對造血支持和調(diào)控起很大的作用，可以通過分泌TPO、SCF、TGF-β、LIF、G-CSF及白介素家族等細(xì)胞因子，依靠旁分泌作用，改變造血干細(xì)胞所處的微環(huán)境，使造血干細(xì)胞維持靜止，或者產(chǎn)生促進(jìn)自我更新或分化等作用[20]，同時(shí)依靠可溶性分子SDF/CXCR4等趨化因子和整合素家族介導(dǎo)的細(xì)胞間接觸作用，更精細(xì)地調(diào)控造血干細(xì)胞的增殖和分化[21]。但是，目前MSC在造血干細(xì)胞向巨核細(xì)胞分化過程中所起的作用存在爭議[12-14]。一方面，MSC通過對造血干細(xì)胞干性維持，阻礙了造血干/祖細(xì)胞的分化和成熟；另一方面，MSC同時(shí)也參與構(gòu)成造血干細(xì)胞向巨核細(xì)胞分化的微環(huán)境，通過提供巨核分化過程中的主要調(diào)控因子和生長因子，刺激造血干/祖細(xì)胞向巨核細(xì)胞的分化及血小板的生成。本研究中，我們對MSC的作用進(jìn)行了深入分析。

從我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，與單獨(dú)利用細(xì)胞因子誘導(dǎo)培養(yǎng)相比，通過直接接觸的共培養(yǎng)方式，懸浮細(xì)胞的數(shù)量得到了明顯的增加，但CD41a、CD61雙陽性細(xì)胞的比例并沒有很明顯的變化，實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果顯示，雖然巨核相關(guān)基因的表達(dá)有所增加，但效果微弱。這一結(jié)果與Zweegman等的報(bào)道一致，即MSC主要對造血干/祖細(xì)胞的擴(kuò)增發(fā)揮作用，并不促進(jìn)巨核細(xì)胞的分化。有報(bào)道顯示MSC表面表達(dá)CX?CL-12、FGF-4等趨化因子和黏附分子，造血干細(xì)胞可通過這些表面分子貼附于MSC表面甚至穿過MSC之間的間隙，進(jìn)入間充干細(xì)胞的下面，此時(shí)所處的微環(huán)境不同，造血干細(xì)胞的分化傾向性就會(huì)不同。因此，我們設(shè)計(jì)了4種不同的共培養(yǎng)方式進(jìn)行對比。用Trans-well上的0.1 μm膜隔開2種干細(xì)胞，使之進(jìn)行非接觸培養(yǎng)，造血干細(xì)胞只能受MSC的旁分泌作用的影響；而直接共培養(yǎng)組除此之外，還接受細(xì)胞間接觸作用的影響。在細(xì)胞增殖方面兩者之間并沒有明顯差異，但在巨核分化中，非接觸培養(yǎng)組明顯優(yōu)于接觸組。該結(jié)論同時(shí)也證實(shí)了另一種觀點(diǎn)，即MSC具有促巨核細(xì)胞分化的作用，而MSC對巨核細(xì)胞作用的效果取決于是否存在接觸抑制作用。這是由于MSC表面的分子產(chǎn)生了維持干性，抑制巨核分化的作用，還是由于與造血干細(xì)胞直接接觸共培養(yǎng)使MSC發(fā)生了變化，分泌的促巨核分化的相關(guān)因子減少，還有待于進(jìn)一步研究確定。綜上推測，MSC在非接觸共培養(yǎng)的情況下更易促進(jìn)巨核細(xì)胞的分化和成熟。該誘導(dǎo)培養(yǎng)體系不添加血清，只使用人源基質(zhì)細(xì)胞，對未來體外大規(guī)模誘導(dǎo)巨核細(xì)胞將有指導(dǎo)意義。

同時(shí)，我們就臍帶和骨髓這2種臨床上最常用的MSC對巨核細(xì)胞分化和增殖的促進(jìn)作用進(jìn)行了初步對比。在非接觸培養(yǎng)條件下，我們的研究結(jié)果提示骨髓來源的MSC對巨核細(xì)胞的分化促進(jìn)作用明顯優(yōu)于臍帶來源的，而本研究中使用的骨髓MSC能表達(dá)更高水平的IL-6、IL-7、LIF及分泌型SCF，推測這些細(xì)胞通過旁分泌作用更好地促進(jìn)巨核細(xì)胞分化。Robinson等的研究同樣提示，MSC的來源不同，發(fā)揮的維持造血干細(xì)胞自我更新、促進(jìn)分化的能力也各不相同[22]。進(jìn)一步確定不同來源的MSC在分泌表達(dá)細(xì)胞因子水平上的差異，對于選擇優(yōu)化基質(zhì)細(xì)胞用于造血干/祖細(xì)胞的維持和誘導(dǎo)將有指導(dǎo)意義。根據(jù)檢測到的2種MSC分泌因子的表達(dá)水平，也可對巨核培養(yǎng)體系中各因子間的配比進(jìn)行一定的優(yōu)化。這一結(jié)果將為體外獲得更多更成熟的巨核細(xì)胞奠定基礎(chǔ)。

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