李麗華，邱健健，蔡藝欽，于鵬，劉靜雯＊

（1.集美大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門361021；2.福建省高校食品微生物與酶工程技術(shù)研究中心，福建 廈門361021）

1 引言

海洋微藻類病毒廣泛分布于自然海域。病毒的裂解是導(dǎo)致浮游植物死亡和種群數(shù)量減少的主要因素之一，并控制著浮游植物群落的多樣性和豐度［1］。病毒和宿主在不斷相互作用過程中，通過相互競爭并協(xié)同進(jìn)化以防止自身的滅亡［2］。從阻止病毒DNA的注入到干擾病毒DNA的復(fù)制、RNA轉(zhuǎn)錄以及子代病毒的形成，宿主進(jìn)化出了一系列的防御機(jī)制來破壞病毒的感染系統(tǒng)。相應(yīng)地，為了實(shí)現(xiàn)自身的最大增殖，病毒也形成許多策略逃避宿主的防御系統(tǒng)，如在感染宿主后，病毒將自身基因組攜帶的基因或是從上個(gè)宿主細(xì)胞中獲得的基因整合到宿主基因組中——即基因橫向轉(zhuǎn)移，這些基因表達(dá)的蛋白能夠阻止宿主細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞內(nèi)激酶的降解、刺激細(xì)胞生長，從而為自身復(fù)制創(chuàng)造便利條件［1，3］。

海洋球石藻Coccolithophores是一類生活于海洋中的單細(xì)胞微型浮游植物，廣泛分布在世界范圍的近海和大洋水域中，尤其是亞極地較高緯度海區(qū)的優(yōu)勢種類，也是該海域典型的赤潮種。大量研究證實(shí)病毒感染是終止球石藻Emilianiahuxleyi赤潮的一個(gè)重要因素［4］。目前已分離到十多株海洋球石藻病毒，均為雙鏈DNA病毒，已被確定為雙鏈DNA病毒科中的一個(gè)新屬——Coccolithovirus［5—6］。對海洋球石藻病毒（E.huxleyivirus）Eh V86基因組測序注釋結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該基因組包含472個(gè)編碼基因，其中85%的基因被預(yù)測為編碼膜蛋白，但其確切功能未知，僅有約14%的基因在數(shù)據(jù)庫中具有功能歸屬［7］。該病毒編碼的功能基因主要包括：參與細(xì)胞氧化還原反應(yīng)的硫氧還蛋白（Trx）基因、構(gòu)成病毒顆粒的基本組成單元的主要外殼蛋白（MCP）基因和介導(dǎo)鞘脂類物質(zhì)代謝的鞘脂類物質(zhì)合成基因（SBP）等［7］。另外一些基因編碼的蛋白酶可能與病毒吸附、宿主識(shí)別、Caspase介導(dǎo)的凋亡途徑、信號級聯(lián)通路、活性氧的調(diào)控、成熟病毒組裝和釋放等功能緊密相關(guān)［7］。目前，在Eh V86基因組中，有5種被預(yù)測為編碼絲氨酸蛋白酶的基因，分別為ehv021、ehv361、ehv447、ehv151和ehv160，其中ehv021、ehv151和ehv160被預(yù)測為胰蛋白酶超家族［7—8］。微陣列分析這些基因的轉(zhuǎn)錄情況表明，除了ehv361外，所有病毒編碼的絲氨酸蛋白酶均在感染過程中表達(dá)［7—8］。但絲氨酸蛋白酶基因的表達(dá)與病毒感染之間的相互關(guān)聯(lián)尚不清楚。

絲氨酸蛋白酶（serine proteinase，Sp）是一類以絲氨酸為活性中心的重要的蛋白水解酶，廣泛存在于動(dòng)物、植物、細(xì)菌、病毒、真菌中，參與生命的各種反應(yīng)如蛋白質(zhì)翻譯后的加工、細(xì)胞分裂、病原體感染、宿主的防御、組織降解及細(xì)胞凋亡等，它們通過對蛋白酶原的激活或抑制而起調(diào)節(jié)因子作用［9］。研究發(fā)現(xiàn)ATP依賴的絲氨酸蛋白酶具有一個(gè)保守的生理功能，即作為分子伴侶，不僅起到水解的作用，還具有蛋白組裝及蛋白復(fù)合體降解等功能［10］，從而介導(dǎo)一系列控制熱激反應(yīng)、噬菌體的生命周期和細(xì)胞程序性死亡（PCD）等過程的蛋白質(zhì)的降解［11—12］。有些致病性真菌在感染宿主過程中自身分泌的內(nèi)源性蛋白酶包含有絲氨酸蛋白酶以破壞宿主細(xì)胞正常的生理代謝功能，同時(shí)也刺激宿主應(yīng)激性地產(chǎn)生絲氨酸蛋白酶作為信號分子誘導(dǎo)宿主防御系統(tǒng)基因的表達(dá)，從而對抗病原菌的侵染［13］。海洋微藻類病毒與其宿主是否也存在類似的相互作用尚未見報(bào)道。目前報(bào)道的絲氨酸蛋白酶有很多，諸如參與植物器官衰老的植物絲氨酸蛋白酶［14］，也有利用基因工程技術(shù)克隆表達(dá)的微生物絲氨酸蛋白酶，如稻瘟病原菌絲氨酸蛋白酶［13］，以研究其結(jié)構(gòu)與功能。

本研究以海洋球石藻E.huxleyi病毒Eh V99B1為研究對象。從Eh V99B1基因組中克隆Sp基因，對該基因序列進(jìn)行系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析，并于大腸桿菌中進(jìn)行重組表達(dá)及活性分析，為進(jìn)一步研究Eh V99B1－Sp在微藻病毒與宿主相互作用過程中的調(diào)節(jié)作用及其功能與應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

2.1.1 海藻和病毒

實(shí)驗(yàn)用海洋球石藻Emilianiahuxleyi株系為Eh－BOF92；病毒株為Eh V99B1，均分離自挪威海域，由挪威卑爾根大學(xué)生物系Gunnar教授贈(zèng)送。

2.1.2 菌種與試劑

TaqDNA聚合酶、T4DNA連接酶、核酸內(nèi)切酶EcoR I和NotI均購自Ta Ka Ra公司產(chǎn)品，p MD19－T載體購自碧云天生物技術(shù)研究所，DNA凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒為TIANGEN公司產(chǎn)品，大腸桿菌菌株Top10、E.coilBL21和p ET32a表達(dá)載體均為本實(shí)驗(yàn)室保存，瓊脂糖為西班牙進(jìn)口分裝，測序由廣州英駿生物技術(shù)有限公司完成，鯉魚肌肉絲氨酸蛋白酶（MBSP）抗體由集美大學(xué)生物工程學(xué)院曹敏杰教師實(shí)驗(yàn)室自制，其余試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank上報(bào)道的Eh V86病毒基因組的絲氨酸蛋白酶序列，采用GeneDoc軟件和Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)引物。本實(shí)驗(yàn)所用引物為：

F∶5’－CGGAATTCATTTCAAGAGTATTGGCAGT CG－3’（劃線部分為EcoR I酶切位點(diǎn)）；R∶5’－ATTGCGGCCGCTTATTGTATGTGATTCGTT －3’（劃線部分為NotI酶切位點(diǎn)）。

2.2.2 病毒DNA的提取

采用CTAB法提取病毒基因組DNA［15］。

2.2.3 Eh V99B1－Sp基因的PCR擴(kuò)增

以提取的病毒基因組DNA為模板，在25μL反應(yīng)體系中（無菌dd H2O 7.5μL，Taq預(yù)混液12.5 μL，模板3μL，引物F和R各1μL）進(jìn)行PCR，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min，95℃ 30 s，50℃ 60 s，72℃90 s，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠檢測，使用DNA凝膠回收試劑盒回收。

2.2.4 感受態(tài)細(xì)胞的制備

制備方法參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（第3版）》［16］。

2.2.5 Eh V99B1－Sp基因的克隆

（1）T克隆的構(gòu)建

按照T載體：PCR產(chǎn)物＝1∶5～8的比例，取回收的PCR產(chǎn)物4μL，T載體1μL和T4DNA ligest solutionⅠ5μL混合，于16℃連接16 h。

（2）轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞

將10μL T克隆連接產(chǎn)物加入到200μL的感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30 min，42℃熱激90 s，冰浴2 min。加入到含有800μL LB培養(yǎng)基（1%蛋白胨，0.5%酵母膏，1%NaCl，p H 7.0）的試管中混勻，37℃培養(yǎng)1 h。取未離心菌液200μL涂布含氨芐青霉素（終濃度為0.1 mg／mL）的LB固體平板（1%蛋白胨，0.5%酵母提 取 物，1%NaCl，p H 7.0，預(yù)先涂有40μL 20 mg／mL的X－gal與4μL 200 mg／mL的IPTG），同時(shí)將剩余菌液于8 000 r／min離心1 min，分別取上清、沉淀各200μL涂布平板（同上），于37℃倒置培養(yǎng)約12 h。

（3）重組質(zhì)粒p MD19－T－Eh V99B1－Sp的篩選與鑒定

用滅菌的牙簽挑取白斑，接種于含有氨芐青霉素（終濃度0.1 mg／mL）的LB液體培養(yǎng)基中37℃搖床上振蕩培養(yǎng)約12 h。質(zhì)粒小量抽提試劑盒提取質(zhì)粒，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測確定重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)PCR和雙酶切驗(yàn)證，雙酶切采用20μL體系：10×H buffer 2μL，0.1%BSA 2μL，EcoRI 1μL，NotI 1 μL，重組質(zhì)粒14μL，37℃反應(yīng)3.5 h，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測；陽性克隆送至廣州英駿生物技術(shù)有限公司測序。

2.2.6 Eh V99B1－Sp生物信息學(xué)分析

利用DNAStar、Blast等軟件對測序結(jié)果進(jìn)行分析并預(yù)測其一級結(jié)構(gòu)；利用MEGA4.1分析軟件建立系統(tǒng)進(jìn)化樹；然后再利用GeneDoc、Clustal X、Raswin等軟件和http／／www.expasy.ch／tools／protparam.html、http／／espript.ibcp.fr／ESPript／ESPript／index.php、http／／swissmodel.expasy.org等在線軟件對其二級和三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，并利用Ex PASy網(wǎng)站的Prot Scale程序分析蛋白疏水性結(jié)構(gòu)（http：／／us.expasy.org／cgi－bin／protscale.pl）、蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)（http：／／www.ch.embnet.org／soft ware／TMPRED－for m.html）及信號肽區(qū)域（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／Signal P／）。

2.2.7 p ET32a－Eh V99B1－Sp重組質(zhì)粒的構(gòu)建

提取p MD19－T－Eh V99B1－Sp克隆質(zhì)粒和表達(dá)載體p ET32a，用EcoRI及NotI分別對p MD19－TEh V99B1－Sp克隆質(zhì)粒和表達(dá)載體p ET32a進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物用DNA凝膠回收試劑盒回收，T4 DNA ligest sol ution I對回收產(chǎn)物進(jìn)行連接（連接反應(yīng)為10μL體系：回收目的基因4μL，p ET32a載體1μL，T4DNA ligest sol utionI 5μL，于16℃連接16 h）；轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌Top10，提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR和酶切鑒定；陽性重組表達(dá)質(zhì)粒（p ET32a－Eh V99B1－Sp）轉(zhuǎn)化E.coliBL21（過程同1.2.5.2），進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證（挑取固體平板上的單菌落，重懸于20μL無菌水中，100℃煮沸10 min，離心取上清；取3μL上清作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min，95℃30 s，50℃60 s，72℃90 s，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2.2.8 重組菌株（BL21／p ET32a－Eh V99B1－Sp）的活性檢測

將陽性重組菌（BL21／p ET32a－Eh V99B1－Sp）和實(shí)驗(yàn)對照菌株（BL21／p ET32a）分別接種于含有氨芐青霉素（終濃度0.1 mg／mL）的1%脫脂牛奶平板（包括1%脫脂奶粉，1%瓊脂溶于蒸餾水），37℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落水解情況。

2.2.9 p ET32a－Eh V99B1－Sp在E.ColiBl21誘導(dǎo)表達(dá)

將陽性重組菌株（BL21／p ET32a－Eh V99B1－Sp）和實(shí)驗(yàn)對照菌株（BL21／p ET32a）分別接種于含有氨芐青霉素（終濃度0.1 mg／mL）的LB液體培養(yǎng)基中（包括1%蛋白胨、0.5%酵母膏、1%Na Cl，p H 7.0），37℃ 振蕩培養(yǎng)至OD600達(dá) 到 0.7 左 右，從IPTG 濃度（0.3 mmol／L、0.5 mmol／L、0.8 mmol／L、1.0 mmol／L）、誘導(dǎo)溫度（18℃、25℃、30℃、37℃）和誘導(dǎo)時(shí)間（3 h、5 h、7 h、10 h、12 h）等三方面進(jìn)行表達(dá)條件優(yōu)化，離心收集菌體并重懸于PBS中，超聲波破碎，4℃、12 000 r／min離心，將沉淀重懸于等體積的PBS中，分別取全細(xì)胞、上清和沉淀進(jìn)行SDS－PAGE。

2.2.10 重組蛋白 Eh V99B1－Sp的純化和 Westernbloting檢測

經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體經(jīng)超聲波破碎，4℃、15 000 r／min離心20 min，取上清過 Ni－NATagarose柱，用含250 mmol／L咪唑的洗脫緩沖液洗脫目的蛋白（參照Qiagen公司鎳離子親和層析柱操作說明），SDS－PAGE檢測目的蛋白的純度。用 Western－bloting檢測目的蛋白的特異性，Western－bloting中所用的一抗為鯉魚肌肉絲氨酸蛋白酶（MBSP），稀釋比例1∶100，二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠Ig G，稀釋比例1∶200，用DAB顯色。

3 結(jié)果

3.1 Eh V99B1－Sp的擴(kuò)增

以Eh V99B1基因組為模板，PCR擴(kuò)增獲得大小約為1 110 bp的DNA片段（GenBank，登陸號：KC161207）。構(gòu)建p ET32a－Eh V99B1－Sp重組表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，PCR和雙酶切鑒定結(jié)果如圖1。

圖1 Eh V99B1－Sp重組載體雙酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of the digest product of the p ET32a－Sp recombinant plasmid Lane

3.2 Eh V99B1－Sp基因的分子生物學(xué)特征

3.2.1 Eh V99B1－Sp的同源性比對及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析

多重同源性比對發(fā)現(xiàn)：該克隆片段與GenBank中Eh V86分離株（登陸號：NC＿007346）的同源性為95%，氨基酸序列的同源性為97%，而與其他物種的Sp氨基酸序列同源性僅為28%～32%。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，Eh V之間的Sp自成一支且與Ctenocephalidesf elis貓櫛首蚤的距離最近，與其他種類從低級至高級越來越遠(yuǎn)（見圖2）。

3.2.2 Eh V99B1－Sp生化特性和結(jié)構(gòu)分析

用在線軟件分析表明，該基因編碼的蛋白質(zhì)有368個(gè)氨基酸，相對分子量約為39.6 k Da，理論等電點(diǎn)（pI）為6.255，其包含36個(gè)堿性氨基酸，33個(gè)酸性氨基酸，115個(gè)疏水性氨基酸，128個(gè)極性氨基酸?？缒そY(jié)構(gòu)分析該蛋白是一個(gè)二次跨膜蛋白，具有典型的LTAGHC（組氨酸活性位點(diǎn)區(qū)域）和AICNGDSGGPLF（絲氨酸活性位點(diǎn)區(qū)域）兩個(gè)絲氨酸蛋白酶水解催化活性位點(diǎn)的氨基酸基序；其二級結(jié)構(gòu)中包含2個(gè)α螺旋，15個(gè)β折疊（見圖3a）。

圖2 基于Eh V99B1－Sp和GeneBank中其他9種物種Sp氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic inference tree based on the amino acid sequences of Sp from different organisms in GenBank

以物種blackrat（PDB登錄號：1ANE）為模板預(yù)測Eh V99B1－Sp的三級結(jié)構(gòu)，兩個(gè)物種的絲氨酸蛋白酶的三級結(jié)構(gòu)都具有一個(gè)疏水口袋（活性部位），AICNGDSGGPLF位于該酶催化活性部位的核心位置，其周圍的α螺旋和β折疊區(qū)域展開形成口袋結(jié)構(gòu)，His87、Asp187和Ser245組成催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)（見圖3b）。

3.3 p ET32a－Eh V99B1－Sp的活性檢測

在1%脫脂牛奶平板上，對照BL21－p ET32a不形成降解牛奶的水解圈，而 BL21－p ET32a－Eh V99B1－Sp則降解牛奶形成明顯的水解圈，表明其分泌的蛋白酶具有生物學(xué)活性（見圖4）。

3.4 p ET32a－S p在E.coli BL21中的表達(dá)及純化的電泳檢測

p ET32a表達(dá)載體融合了Trx和His標(biāo)簽蛋白，標(biāo)簽的大小為20.5 k Da，目的基因表達(dá)的蛋白在39.5 k Da左右，融合蛋白的預(yù)計(jì)分子量約為60 k Da。通過優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件，最終用終濃度為0.5 mmol／L的IPTG在18℃誘導(dǎo)10 h獲得了高效表達(dá)，可溶性蛋白占總蛋白的23.4%。經(jīng)Ni－NATagarose親和層析獲得純化的重組蛋白（見圖5a）。

3.5 Western－bloting檢測目的蛋白的特異性

取少量純化蛋白和未誘導(dǎo)菌體蛋白（陰性對照）進(jìn)行SDS－PAGE，電轉(zhuǎn)移至NC膜。用鯉魚肌肉MBSP作為一抗，HRP標(biāo)記的兔抗鼠Ig G作為二抗，DAB顯色后在預(yù)期大?。?0 k Da）處可見清晰染色條帶，分子量為60 k Da（見圖5b），表明重組表達(dá)蛋白為絲氨酸蛋白酶。

4 討論

絲氨酸蛋白酶是一類以絲氨酸為活性中心的重要的蛋白水解酶，在生物有機(jī)體中發(fā)揮著重要的生理作用，具有廣泛的研究和應(yīng)用價(jià)值［9］。絲氨酸蛋白酶超家族成員具有多種多樣的生理功能，在機(jī)體很多致病過程以及細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面起著重要作用。在長期的進(jìn)化過程中，絲氨酸蛋白酶氨基酸序列產(chǎn)生了很大的差異，絲氨酸蛋白酶超家族成員的某些蛋白質(zhì)序列的相似度甚至低于20%，但該蛋白質(zhì)的活性結(jié)構(gòu)域卻極其保守，都具有一個(gè)類似于口袋狀的核心催化結(jié)構(gòu)域 Asp－His－Ser［17］。由于絲氨酸蛋白酶在結(jié)構(gòu)上的微小變化，導(dǎo)致其在功能上的進(jìn)化。本實(shí)驗(yàn)從Eh V99B1中克隆獲得了Eh V99B1－Sp基因，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Western－bloting檢測，顯示純化獲得的蛋白為絲氨酸蛋白酶，分子量大小與預(yù)期的相符合，生物信息學(xué)分析與其他物種的Sp蛋白的同源性很低，只有28%～32%，但其蛋白結(jié)構(gòu)域中也保留了LTAGHC和AICNGDSGGPLF兩個(gè)非常保守的水解酶催化活性位點(diǎn)的氨基酸基序。說明球石藻病毒的Sp在結(jié)構(gòu)與功能上與其他物種之間存在著一定的差異，可能是絲氨酸蛋白酶家族的一個(gè)新成員。

圖3 Eh V99B1－Sp蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測圖Fig.3 Predictions of the structures of Eh V99B1－Sp.

圖4 1%脫脂牛奶平板檢測重組菌BL21－p ET32a－Eh V99B1－Sp的蛋白酶酶活Fig.4 Analysis of Eh V99B1－Sp protease activity on the 1%degreased milk plate

基因橫向轉(zhuǎn)移是指遺傳物質(zhì)從一個(gè)生物體轉(zhuǎn)移到另一個(gè)不同的生物體中，或者單個(gè)細(xì)胞內(nèi)部的細(xì)胞器之間進(jìn)行遺傳物質(zhì)的交流，生物個(gè)體之間進(jìn)行遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移沒有親緣關(guān)系以及方向的界限［18］?；驒M向轉(zhuǎn)移現(xiàn)象廣泛存在于噬菌體、真核病毒以及一些普通的轉(zhuǎn)導(dǎo)粒子。大量的研究表明病毒能夠利用基因橫向轉(zhuǎn)移影響宿主的新陳代謝、免疫能力和分布情況，最為典型的例子要屬藍(lán)藻病毒，其基因組攜帶有來自宿主的光合作用基因（如psbA和psbD），這些基因在強(qiáng)光下可誘導(dǎo)表達(dá)，被認(rèn)為是在藍(lán)藻病毒裂解周期中用于延長光合作用效應(yīng)來維持該病毒質(zhì)子泵系統(tǒng)的運(yùn)轉(zhuǎn)［19］，類似的現(xiàn)象也在痘病毒和Mi mi病毒中被發(fā)現(xiàn)［20—21］。另外，研究發(fā)現(xiàn)海洋紅細(xì)菌Rhodobacter和玫瑰桿菌Rosebacterlitor alis的普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)子可以作為載體將宿主基因包裹在其病毒顆粒內(nèi)，通過洋流橫向轉(zhuǎn)移給其他生態(tài)系統(tǒng)的細(xì)菌，促使同一類群細(xì)菌基因組協(xié)同進(jìn)化［22—23］。因此，基因橫向轉(zhuǎn)移現(xiàn)象其實(shí)質(zhì)是宿主與病毒相互作用的結(jié)果。在Eh V基因組中存在7個(gè)預(yù)測編碼SBP關(guān)鍵催化酶的基因，這些基因不存在于其他已知的病毒中，但是存在于宿主基因組中，證實(shí)SBP基因在病毒和真核生物之間進(jìn)行了橫向轉(zhuǎn)移［24］。本研究獲得的Eh V99B1－Sp基因與宿主的Sp基因同源性只有34.2%，因此，我們推測該病毒的Sp基因并非從宿主細(xì)胞直接通過基因橫向轉(zhuǎn)移獲得，而可能是在長期進(jìn)化過程中由病毒自身攜帶或者從其他生物逐步轉(zhuǎn)移而來。

圖5 p ET32a－Eh V99B1－Sp重組蛋白表達(dá)的SDS－PAGE分析及 Western－blot分析Fig.5 Analysis of p ET32a－Eh V99B1－Sp fusion protein expressed in E.coli by SDS－PAGE and Western－blot

大量的研究證實(shí)絲氨酸蛋白酶具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用［12—14］。Eh V感染可以誘導(dǎo)宿主細(xì)胞PCD并伴隨著Metacaspase的高活性表達(dá)，而且PCD被認(rèn)為可能是該病毒調(diào)控其宿主死亡的重要方式［25］。絲氨酸蛋白酶不僅可以作為內(nèi)切酶對肽鏈中部起催化作用，還具有切除靶蛋白鏈末端氨基酸殘基的功能［10］。Eh V99B1的全基因組已經(jīng)測序［26］，我們對Eh V99B1中另外3種假定的蛋白酶（ehv109類似于半胱氨酸蛋白酶，ehv133ATP依賴的絲氨酸蛋白酶水解亞基，ehv349半胱氨酸蛋白酶）進(jìn)行胰凝乳蛋白酶酶切位點(diǎn)預(yù)測，發(fā)現(xiàn)這3種蛋白酶中有兩種蛋白酶被預(yù)測存在胰凝乳蛋白酶酶切位點(diǎn)，且分值大于0.5，表明這兩種假定的蛋白酶可能被Eh V99B1－Sp進(jìn)行特異的切割。同時(shí)，生物信息分析顯示Eh V99B1－Sp是一個(gè)二次跨膜蛋白，因此，其可能作為信號通路中的一個(gè)調(diào)節(jié)因子參與Metacaspase酶原的激活，從而參與宿主細(xì)胞PCD進(jìn)程。另外，系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，Eh V99B1－Sp與Ctenocephalidesf elis絲氨酸蛋白酶的同源性較高，而C.f elis絲氨酸蛋白酶可以通過蛋白酶水解切割受體蛋白，使其構(gòu)象發(fā)生改變，從而介導(dǎo)受體的定位和激活，進(jìn)而啟動(dòng)跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)通路［25］，進(jìn)一步為我們的觀點(diǎn)提供了證據(jù)。而且有趣的是，Eh V感染宿主過程中伴隨著神經(jīng)酰胺的合成，而蛋白酶酶原的激活與神經(jīng)酰胺介導(dǎo)的凋亡途徑緊密相關(guān)［7］。神經(jīng)酰胺作為神經(jīng)鞘脂類物質(zhì)的主要成員之一，是機(jī)體調(diào)節(jié)各種細(xì)胞活動(dòng)重要的第二信使，其在胞內(nèi)的合成水平能夠影響多種細(xì)胞活動(dòng)，特別是細(xì)胞凋亡和生長抑制活動(dòng)［27］。因此，絲氨酸蛋白酶作為迄今已知的最大的蛋白酶家族之一，在神經(jīng)酰胺的合成過程中可能發(fā)揮重要的作用。

絲氨酸蛋白酶是一類重要的蛋白水解酶，人們對其結(jié)構(gòu)和功能已經(jīng)進(jìn)行了深入的研究，并有不少種類的絲氨酸蛋白酶已應(yīng)用于醫(yī)藥等領(lǐng)域。在這些研究成果的基礎(chǔ)上人們可以通過絲氨酸蛋白酶基因的克隆、重組、表達(dá)以及蛋白互作等技術(shù)有效提高其產(chǎn)量，為絲氨酸蛋白酶的應(yīng)用提供了新的思路。Eh V99B1－Sp在大腸桿菌中的高表達(dá)可能與下面兩個(gè)因素有關(guān)：第一，低溫條件下誘導(dǎo)能夠降低蛋白的合成速度，促進(jìn)蛋白質(zhì)的正確折疊。第二，Eh V99B1－Sp獲得可溶性表達(dá)可能是由于其N端融合了Trx標(biāo)簽，幫助表達(dá)蛋白形成二硫鍵，從而使蛋白溶解性及活性得到增強(qiáng)。采用革蘭氏陰性大腸桿菌BL21（蛋白酶缺陷型）作為受體菌，證實(shí)克隆基因的表達(dá)產(chǎn)物具有明顯的蛋白酶活性。我們用胰蛋白酶的特異性底物Boc－Phe－Ser－Arg－MCA 和 Boc－Leu－Lys－Arg－MCA 分 析Eh V99B1－Sp的底物特異性，結(jié)果顯示 Boc－Phe－Ser－Arg－MCA和 Boc－Leu－Lys－Arg－MCA 不能被 該酶分解，表明該酶可能是不具有胰蛋白酶特性的絲氨酸蛋白酶。本研究結(jié)果為進(jìn)一步探討Eh V99B1－Sp在球石藻病毒與宿主相互作用過程中的調(diào)節(jié)作用以及該病毒Sp的功能與應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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