王熙濤， 徐永平， 金禮吉， 李淑英， 尤建嵩， 汪 將， 李建光， 張美霞， 宋亞雄

（1.大連理工大學(xué)動(dòng)物生物技術(shù)與營養(yǎng)研究室，遼寧大連 116024；2.大連賽姆生物工程技術(shù)有限公司，遼寧大連 116620；3.動(dòng)物性食品安全保障技術(shù)工程研究中心，遼寧大連 116024）

鼠尾藻、馬尾藻、海帶等海藻是刺參飼料中最常見的飼料原料，其中鼠尾藻被認(rèn)為是刺參的最佳優(yōu)質(zhì)餌料，但是隨著鼠尾藻資源的大量開采，現(xiàn)已面臨供不應(yīng)求，價(jià)格居高不下的困境。而海帶由于其成本低廉、產(chǎn)量高、營養(yǎng)豐富等優(yōu)點(diǎn)也經(jīng)常用作刺參飼料原料（尚德榮等，2011）。但是由于海帶細(xì)胞壁褐藻膠含量較高限制了其作為刺參優(yōu)質(zhì)餌料的使用。刺參體內(nèi)褐藻酸酶活性處于很低的水平，因此對(duì)海帶等富含褐藻膠的大型藻類消化能力較弱，大多數(shù)飼料成分不能被充分消化，這不僅造成飼料的浪費(fèi)，而且水體里含有大量黏性較高的褐藻膠等殘餌，如果處理不當(dāng)也會(huì)導(dǎo)致刺參養(yǎng)殖環(huán)境的惡化（郭娜等，2011；唐黎等，2007）。

針對(duì)以上問題，本研究篩選出一株能高效降解海帶中褐藻膠且對(duì)刺參無潛在危害的有益菌，并探討了其降解海帶褐藻膠的最佳發(fā)酵條件，以期能有效降解海帶飼料中刺參難以消化的褐藻膠成分，從而顯著提高刺參對(duì)海帶的消化率、利用率；并為進(jìn)一步生產(chǎn)刺參微生物脫膠海帶發(fā)酵飼料提供初步理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 健康刺參，購自廣鹿島某海參養(yǎng)殖場，體重5～10 g不等，沙濾海水中暫養(yǎng)2周，不投喂食物，水質(zhì)因子為溶氧≥6 mg/L，溫度控制在（18±1）℃，鹽度為 28‰ ～ 30‰，pH 為 8.0±0.4，每天更換1/3總體積的水以保證水質(zhì)，并吸底排污一次至刺參不再排便為止。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種篩選培養(yǎng)基及降解褐藻膠的發(fā)酵液組成 褐藻酸鈉固體選擇性培養(yǎng)基（%，m/V）：褐藻酸鈉 0.5 g， 硫酸銨 0.5 g，NaCl 3.0 g，K2HPO40.2 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001 g， 瓊脂1.5 g，蒸餾水 100 mL，pH 7.5；褐藻酸鈉液體選擇性培養(yǎng)基（%，m/V）：褐藻酸鈉 0.5 g，硫酸銨 0.5 g，NaCl 3.0 g，K2HPO40.2 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001 g，蒸餾水 100 mL，pH 7.5；降解褐藻膠的發(fā)酵液組成：200 mL搖瓶中含有海帶粉20 g，K2HPO40.2 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001 g，另補(bǔ)充一定濃度褐藻酸鈉、氮源、氯化鈉；種子培養(yǎng)基各成分同褐藻酸鈉液體選擇性培養(yǎng)基。

1.2.2 菌種的分離篩選 采用以褐藻酸鈉為唯一碳源的選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，經(jīng)菌種活化、平皿粗篩、搖瓶復(fù)篩、挑取平皿中長勢良好的單菌落、馴化及菌保等步驟，獲得能降解褐藻膠的菌株W16。

1.2.3 菌株對(duì)刺參的安全性試驗(yàn) 菌種接種于2216E液體培養(yǎng)基中，置28℃、130 r/min下培養(yǎng)12 h后，離心菌液，倒去上清，用滅菌海水重懸制成菌懸液，調(diào)整濃度到5×109cfu/mL。取健康刺參40只，分為兩組，分別為菌懸液組和滅菌海水對(duì)照組。每只刺參一次腹腔注射100 μL菌液，連續(xù)注射3 d，對(duì)照組每個(gè)刺參注射100 μL無菌海水，每日觀察兩次，記錄各組刺參生存狀態(tài)，發(fā)病率。15 d后，統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.2.4 菌株的鑒定

1.2.4.1 16S rDNA基因的PCR擴(kuò)增 按照標(biāo)準(zhǔn)方法 （Wilson，1997）提取菌株 W16的基因組DNA。使用 Smart Taq Pre-Mix試劑盒擴(kuò)增16S rDNA，PCR擴(kuò)增通用引物 （Martin和 Collen，1998）：27F （5'AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3'）；1429R（5'GGTTACCTTGTTACGACTT3'）。

PCR 反應(yīng)體系（50 μL）：DNA 2 μL，正向引物27F（10 pmol/μL）1 μL，反向引物 1492R（10 pmol/μL）1 μL，rTaq DNA 聚合酶 （包含 PCR 反應(yīng)緩沖液，dNTP 混合物）25 μL，ddH2O 21 μL。

PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃復(fù)性 30 s， 共 35個(gè)循環(huán)；72℃延伸 90 s，72℃延伸 10 min；4℃保存。

1.2.4.2 16SrDNA基因測序及菌種鑒定 所得PCR結(jié)果寄送大連萬澤貿(mào)易有限公司測序。測序結(jié)果使用NCBI的Blast軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫中的已知種類的微生物的16S rDNA基因序列進(jìn)行比對(duì)，得到相似度，并繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 海帶褐藻膠相對(duì)降解量的測定 海帶褐藻膠相對(duì)降解量采用紫外吸收法測定，褐藻膠降解產(chǎn)物褐藻寡糖在235 nm處有特征光吸收值。此處的光吸收值的大小可作為褐藻膠相對(duì)降解程度的評(píng)判（Baron 等，1994）。

1.2.6 生物量的測定 取菌懸液200 μL，于600 nm處測定吸光值，以未加菌液的發(fā)酵液作空白對(duì)照。發(fā)酵液中有海帶粉時(shí)，用濾紙過濾除去海帶粉末，再按1.2.5中的方法測吸光值。

1.2.7 海帶褐藻膠降解條件優(yōu)化 海帶褐藻膠降解能力和生物量測定方法如上所述，每組試驗(yàn)重復(fù)兩次，每次試驗(yàn)三組平行，每一步優(yōu)化結(jié)果都用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.7.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株生長和褐藻膠降解量的影響 每隔24 h取一次樣品，研究不同發(fā)酵時(shí)間 ：24、48、72、96、120、144 h對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)菌株W16生長和褐藻膠降解程度的影響。

1.2.7.2 發(fā)酵溫度對(duì)菌株生長和褐藻膠降解量的影響 在以上條件的基礎(chǔ)上，分別在15、20、25、30、35℃下對(duì)菌株W16進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，研究不同溫度對(duì)菌株生長和褐藻膠降解程度的影響。

1.2.7.3 誘導(dǎo)物褐藻酸鈉添加量對(duì)菌株生長和產(chǎn)酶的影響 以褐藻酸鈉作為產(chǎn)褐藻膠裂解酶的誘導(dǎo)物，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同含量的褐藻酸鈉（m/V）：0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%，分別對(duì)菌株W16進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，測定生物量和褐藻膠降解量。

1.2.7.4 補(bǔ)充氮源對(duì)菌株生長和褐藻膠降解程度的影響 分別以 0.3%（NH4）2SO4、0.3%牛肉膏、0.3%NH4Cl、0.3%蛋白胨、0.3%尿素（m/V）為補(bǔ)充氮源加入發(fā)酵液中，研究不同補(bǔ)充氮源對(duì)菌株生長和褐藻膠降解量的影響。

1.2.7.5 氯化鈉濃度對(duì)菌株生長和產(chǎn)酶的影響配制含不同濃度 NaCl（1%、1.5%、2%、2.5%、3%和3.5%）的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，分別對(duì)菌株W16進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，研究不同NaCl濃度對(duì)菌株生長和褐藻膠降解量的影響。

1.2.7.6 起始pH對(duì)菌株生長和產(chǎn)酶的影響 分別調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基初始 pH 為 6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，對(duì)菌株W16進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，研究不同pH對(duì)菌株生長和褐藻膠降解量的影響。

1.2.7.7 裝液量對(duì)菌株生長和產(chǎn)酶的影響 選擇料液比為1∶30，在200 mL三角瓶中，分別裝入20、40、60、80、100、120 mL 的發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌后分別按1%體積加入種子液，研究不同裝液量對(duì)菌株生長和褐藻膠降解量的影響。

1.2.7.8 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 對(duì)上述單因素試驗(yàn)中的7個(gè)因素進(jìn)行考察，選取其中對(duì)菌株W16生長和褐藻膠降解量影響較大的4個(gè)因素設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，綜合考察各因素對(duì)菌株生長和褐藻膠降解量的影響，每個(gè)因素選取3個(gè)水平。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株W16對(duì)刺參安全性試驗(yàn)結(jié)果 5×109cfu/mL菌懸液連續(xù)給刺參腹腔注射3 d，經(jīng)過15 d觀察后，試驗(yàn)組刺參和空白對(duì)照組刺參均在養(yǎng)殖箱中貼壁生長，狀態(tài)良好，未出現(xiàn)腐皮、潰爛或搖頭等不良反應(yīng)，表明高濃度W16對(duì)刺參的生長無任何致病作用。

2.2 16S rDNA分析結(jié)果 對(duì)菌株W16的16S rDNA基因序列測定結(jié)果表明，該菌的16S基因組大小為1421 Da。根據(jù) BLAST軟件在線分析，與該序列相似度大于 95%的序列均來自Bacillus屬細(xì)菌，該序列與Bacillus flexus strain NM25序列的相似度最高，最大匹配度達(dá)到100%。因此，該菌株被鑒定為Bacillus flexus。Bacillus屬系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖1。Bacillus flexus菌種特征為：桿狀，G+，形成卵圓形內(nèi)生芽孢，好氧?？赡?%～10%NaCl濃度。葡萄糖、半乳糖、蔗糖產(chǎn)酸；乳糖、阿拉伯糖、甘露醇、麥芽糖、棉子糖、海藻糖不產(chǎn)酸。接觸酶、氧化酶陽性。

圖1 根據(jù)16S rDNA基因序列構(gòu)建的W16與其親源關(guān)系較近的Bacillus代表菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹

本試驗(yàn)篩選得到一株芽孢桿菌，能降解海帶中褐藻膠且對(duì)刺參無致病性，16S rDNA鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建表明，該菌株與芽孢桿菌Bacillus flexus有較高的同源性。雖然在養(yǎng)殖過程中，很多類型的芽孢桿菌都可作為益生菌加入到飼料中使用，但是從實(shí)際生產(chǎn)的安全性考慮，本試驗(yàn)考察了該菌株對(duì)刺參是否具有潛在致病性，結(jié)果表明在濃度達(dá)到109cfu/mL時(shí)，該菌株仍然對(duì)刺參無任何致病性，因此可作為刺參的有益菌使用。

2.3 發(fā)酵液組成和發(fā)酵條件對(duì)試驗(yàn)菌株生長和降解褐藻膠能力的影響

2.3.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株生長和降解褐藻膠能力的影響 由圖2可見，在發(fā)酵的最初48 h，菌體生長快，生物量達(dá)到最大，但是相對(duì)褐藻膠降解量保持較低水平，并緩慢上升。這可能是因?yàn)閃16不是專一性降解褐藻膠的菌種，在發(fā)酵過程中，菌株W16優(yōu)先利用了發(fā)酵液中其他營養(yǎng)成分，生長旺盛后再逐步利用海帶中褐藻膠，至96 h褐藻膠降解量達(dá)到最大值；當(dāng)繼續(xù)培養(yǎng)時(shí)，菌體逐漸進(jìn)入衰亡期，相對(duì)褐藻膠降解量逐漸下降。因此后續(xù)試驗(yàn)選取96 h作為發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間。

圖2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)W16菌株生長及褐藻膠降解量的影響

2.3.2 發(fā)酵溫度對(duì)菌株生長和褐藻膠降解量的影響 由圖3可見，菌體生長對(duì)試驗(yàn)溫度相對(duì)不敏感，在試驗(yàn)溫度范圍內(nèi)，菌種均生長良好，在25℃時(shí)生物量達(dá)到最大值。試驗(yàn)菌株降解褐藻膠的能力與發(fā)酵培養(yǎng)溫度密切相關(guān)，在10℃時(shí)，菌株降解褐藻膠能力最低，隨著溫度的升高，菌株降解褐藻膠能力也隨著增大。當(dāng)超過30℃時(shí)菌株降解褐藻膠能力又再度下降，因此在30℃時(shí)菌株降解褐藻膠能力最強(qiáng)。因此選定培養(yǎng)溫度為30℃做后續(xù)發(fā)酵試驗(yàn)。

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)菌株生長和褐藻膠降解量的影響

2.3.3 褐藻酸鈉添加量對(duì)菌株生長和褐藻膠降解量的影響 本試驗(yàn)選擇褐藻酸鈉作為誘導(dǎo)劑，考察其添加量對(duì)菌株生長和褐藻膠降解量的影響。由圖4可見，隨著褐藻酸鈉添加量的增加，菌種生物量變化相對(duì)不顯著，但是褐藻膠降解量不斷增大，當(dāng)褐藻酸鈉濃度達(dá)到0.15%時(shí)，菌株降解褐藻膠能力最強(qiáng)，隨著褐藻酸鈉添加量繼續(xù)增加，菌種降解褐藻膠能力未明顯增強(qiáng)，而是趨于穩(wěn)定。因此，選定褐藻酸鈉濃度為0.15%做后續(xù)發(fā)酵試驗(yàn)。

圖4 褐藻酸鈉添加量對(duì)菌株生長和褐藻膠降解量的影響

2.3.4 補(bǔ)充氮源對(duì)菌株生長和褐藻膠降解量的影響

2.3.4.1 不同氮源種類對(duì)試驗(yàn)菌株生長和褐藻膠降解量的影響 由圖5可見，添加不同氮源均能促進(jìn)W16菌株生長，但促進(jìn)程度不同。有機(jī)氮源添加組的生物量均高于無機(jī)氮源添加組，可能是因?yàn)橛袡C(jī)氮源中營養(yǎng)物質(zhì)豐富，更有利于菌株生長，但是無機(jī)氮源組的褐藻膠降解量卻高于有機(jī)氮源組，綜合考慮生物量和褐藻膠降解量，選取二者都相對(duì)較高的硫酸銨做后續(xù)試驗(yàn)。

圖5 不同氮源對(duì)菌株生長和褐藻膠降解量的影響

2.3.4.2 硫酸銨濃度對(duì)菌株生長和褐藻膠降解量的影響 由圖6可見，隨著硫酸銨濃度的增加，試驗(yàn)菌株的生長量和降解褐藻膠的能力表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，在氮源濃度為0.3%時(shí)，測得的生物量和褐藻膠降解量均最高，故選定補(bǔ)充氮源硫酸銨濃度為0.3%做后續(xù)試驗(yàn)。

圖6 硫酸銨濃度對(duì)菌株生長和相對(duì)褐藻膠降解量的影響

2.3.5 氯化鈉濃度對(duì)菌株生長和褐藻膠降解量的影響 由圖7可見，當(dāng)氯化鈉濃度在1.5%～3.5%，對(duì)菌株生物量影響不大，符合海洋細(xì)菌的嗜鹽特點(diǎn)。但是，氯化鈉濃度對(duì)菌株降解褐藻膠能力的影響較大，這與文獻(xiàn)報(bào)道的褐藻膠裂解酶需要Na+、K+的激活相符（Ma 等，2008）。 隨著 NaCl濃度增加，菌株W16產(chǎn)酶能力不斷提高，當(dāng)濃度大于2.5%后變化幅度趨于緩慢，故選擇2.5%NaCl濃度發(fā)酵培養(yǎng)菌株W16。

圖7 NaCl濃度對(duì)菌株生長和褐藻膠降解量的影響

2.3.6 起始pH對(duì)菌株生長和褐藻膠降解量的影響 由圖8可見，發(fā)酵培養(yǎng)液中起始pH對(duì)試驗(yàn)菌株生物量和降解褐藻膠能力均有一定影響，綜合考慮，選取生物量和褐藻膠降解量均較高的pH=7的中性環(huán)境作為后續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)條件。

圖8 起始pH對(duì)菌株生長和褐藻膠降解量影響

2.3.7 裝液量對(duì)菌株生長和褐藻膠降解量的影響 由圖9可見，裝液量的大小主要影響發(fā)酵過程中的通氣及溶氧情況，溶氧水平低，即裝液量太大，不利于菌株生長和產(chǎn)酶。當(dāng)裝液量為50 mL時(shí)，生物量和褐藻膠降解量均達(dá)到最大值，因此選取40 mL裝液量最為適宜。

圖9 裝液量對(duì)菌株生長和褐藻膠降解量的影響

2.3.8 正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵條件 采用正交試驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。綜合考慮選取對(duì)褐藻膠降解能力有較大影響的4個(gè)因素，即：發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵起始pH、發(fā)酵溫度和褐藻酸鈉濃度，按照四因素三水平L9（34）安排正交試驗(yàn)。發(fā)酵時(shí)間為A1=72 h，A2=96 h，A3=120 h；發(fā)酵起始 pH 為 B1=6.5，B2=7，B3=7.5；發(fā)酵培養(yǎng)溫度為 C1=25℃，C2=30 ℃，C3=35℃；發(fā)酵培養(yǎng)基中褐藻酸鈉濃度（m/V）為D1=0.1%，D2=0.15%，D3=0.2%。其他條件為氯化鈉濃度2.5%，硫酸銨濃度0.3%，裝液量40 mL（料液比=1∶30），160 r/min 振蕩培養(yǎng)。

由表1可見，最佳褐藻膠降解條件為：A2B3C2D3。由極差分析可以看出，4個(gè)因素對(duì)菌株W16生長和產(chǎn)酶的影響由大到小次序?yàn)椋篈（發(fā)酵時(shí)間）>D（褐藻酸鈉濃度）>B（發(fā)酵起始 pH）>C（發(fā)酵溫度）。因此，A為影響菌株生長和褐藻膠降解能力的最主要因素，其次為誘導(dǎo)物褐藻酸鈉濃度。菌株W16降解褐藻膠的最佳條件為：發(fā)酵時(shí)間96 h、發(fā)酵起始pH 7.5、發(fā)酵溫度30℃、褐藻酸鈉濃度0.2%。經(jīng)正交試驗(yàn)優(yōu)化后，其發(fā)酵液中褐藻膠相對(duì)降解量即OD235為0.531，比優(yōu)化之前的OD235提升了3.29倍。

表1 正交試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

本研究采用以褐藻酸鈉為唯一碳源的選擇性培養(yǎng)基，從海泥中篩選出一株能降解海帶褐藻膠的菌株W16，經(jīng)16SrDNA鑒定，該菌株與芽孢桿菌Bacillus flexus有較高的同源性。經(jīng)安全性試驗(yàn)證明，此菌株濃度達(dá)到109cfu/mL時(shí)對(duì)刺參無致病性，可用其降解刺參海帶飼料中的高黏度且不宜被刺參消化的褐藻膠。

為使菌株W16降解海帶飼料中褐藻膠的能力達(dá)到最大，進(jìn)行了發(fā)酵條件優(yōu)化，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上選取對(duì)褐藻膠降解量影響較大的4個(gè)因素進(jìn)行了正交試驗(yàn)，得到菌株W16降解褐藻膠的最佳條件為：發(fā)酵時(shí)間96 h、發(fā)酵起始pH 7.5、發(fā)酵溫度30℃、褐藻酸鈉濃度0.2%，另添加0.3%的無機(jī)氮源硫酸銨、2.5%的氯化鈉，裝液量40 mL（200 mL搖瓶，20 g海帶粉體系），搖床轉(zhuǎn)速160 r/min，按1%（V/V）接種量接種。經(jīng)正交試驗(yàn)優(yōu)化后，其發(fā)酵液中褐藻膠相對(duì)降解量比優(yōu)化之前提高了3.29倍。

[1]郭娜，董雙林，劉慧.幾種飼料原料對(duì)刺參幼參生長和體成分的影響[J].漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展，2011，32（1）：123 ～ 128.

[2]尚德榮，寧勁松，趙艷芳，等.海帶中褐藻膠含量測定方法的建立[J].食品科技，2011，36（8）：252 ～ 254.

[3]唐黎，王吉橋，許重，等.不同發(fā)育期的幼體和不同規(guī)格刺參消化道中四種消化酶的活性[J].水產(chǎn)科學(xué)，2007，26（5）：275 ～ 277.

[4]Baron A J，Wong T Y，Hicks S J，et al.Alginate lyase from Klebsiella pneumonia，subsp.aerogenes：gene cloning，sequence analysis and high-level production in Escherichia coli[J].Gene，1994，143：61 ～ 66.

[5]Ma LY，Chi Z M，Li J，et al.Overexpression of alginatelyase of Pseudoalt eromonas elyakovii in Escherichia coli，puri-fication，and characterization of the recombinant alginate lyase[J].World J Microbiol Biotechnol，2008，24：89 ～96.

[6]Martin F，Collen M.Bias in template-to-product ratios in multi-template PCR[J].Appl Microbiol Biotechnol，1998，64（10）：3724 ～ 3730.

[7]Wilson K.Preparation of genomic DNA from bacteria[A].Current Protocols in Molecular Biology[C].1997.241～245.■