馬 鵬，劉子玥，呂亞楠，張延明＊＊，晉齊鳴，賈 嬌

(1.哈爾濱師范大學(xué);2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院)

0 引言

玉米作為中國(guó)乃至全世界第一大糧食作物，是重要的糧食作物和飼料來(lái)源，同時(shí)也是全球總產(chǎn)量最高的經(jīng)濟(jì)糧食作物.而玉米絲黑穗病作為一種全球性的病害已經(jīng)嚴(yán)重的影響了全球各地玉米的產(chǎn)量，同時(shí)也是制約我國(guó)玉米產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的主要病害之一［1］.玉米絲黑穗病又名烏米、啞玉米等，在華中、華北、華南、東北、西北和西南地區(qū)都普遍發(fā)生.2002年?yáng)|北地區(qū)玉米絲黑穗病大面積的發(fā)生，其平均發(fā)病率為10% ～15%，嚴(yán)重的地區(qū)高70% ～80%［2］.隨著玉米感病品種的大規(guī)模種植，玉米絲黑穗病的發(fā)病率一年高過(guò)一年［3］，并且已經(jīng)成為了危害我國(guó)玉米產(chǎn)量的重要病害.因此，尋找一種能夠快速且有效的方法對(duì)玉米絲黑穗病進(jìn)行檢測(cè)顯得尤為重要，為研究絲孢堆黑粉菌的致病機(jī)理，尋找防治該病害的新途徑、新方法提供技術(shù)支持.

在對(duì)植物進(jìn)行某種病原檢測(cè)中，通常使用的是PCR檢測(cè)技術(shù).PCR技術(shù)用來(lái)檢測(cè)病原物是指選擇某一特定的引物去擴(kuò)增相應(yīng)的目的DNA片段［4］.該實(shí)驗(yàn)所采用的引物是由上海生工生物公司合成的玉米絲黑穗病菌的特異性引物(GSP)，然后采用PCR擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)可以對(duì)玉米病苗中的絲黑穗病菌基因組進(jìn)行特異性的擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增的樣品DNA進(jìn)行濃度為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，最后在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行觀察和記錄，從而得知玉米是否感染了絲黑穗病.最后計(jì)算出該特異性引物GSP對(duì)玉米病苗的檢測(cè)效率，看是否可以用于快速有效的對(duì)玉米感病植株在發(fā)病之前對(duì)病菌進(jìn)行檢測(cè).

1 材料與方法

1.1 材料準(zhǔn)備

(1)絲黑穗冬孢子的觀察

稱取10 mg已經(jīng)處理好的玉米絲黑穗病菌冬孢子粉，將其置于1.5 mL的離心管中，加入適量的無(wú)菌水浸泡過(guò)夜，然后置于高速離心機(jī)中離心2 min(10000 r/min)，棄掉上清液.再用無(wú)菌水處理1 d，再次離心并棄掉上清液［5］.將已經(jīng)處理好的冬孢子沉淀浸泡于配置好的2%葡萄糖溶液中，置于28℃的溫箱中黑暗培養(yǎng)3 d，3 d后觀察冬孢子的萌發(fā)狀態(tài).

(2)試驗(yàn)材料及病菌

玉米感病品種(黃早4)，植物DNA提取試劑盒(寶生物公司購(gòu)買)，供試絲黑穗病菌(將事先收集好的病菌樣品置于室內(nèi)晾干，再用篩子充分篩選出孢子粉，將孢子粉置于通風(fēng)、陰涼、干燥處保存?zhèn)溆?.

(3)配置菌土

土壤采樣后放入高壓滅菌鍋中進(jìn)行滅菌，待土壤冷卻后加入玉米絲黑穗菌粉配置成1%的菌土.

(4)播種與接種

選取200粒感病品種黃早4，將種子在4月20日播種于吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院所屬的玉米試驗(yàn)田(公主嶺)，每穴2～3粒，將配置好的菌土覆蓋在玉米種子上.

(5)取樣

在玉米抽穗前期(此時(shí)病狀并未表現(xiàn)出來(lái))對(duì)玉米的根與葉片組織進(jìn)行采樣.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA的提取方法(采用試劑盒提取，提取方法參照說(shuō)明書)

將采集的每份玉米根與葉片的樣品取適量置于研缽中用液氮充分的研磨，將研磨好的樣品組織(不多于50 mg)分裝于1.5 mL的離心管中，并分別做好標(biāo)記.加入400μL LE Buffer，上下顛倒混合均勻，迅速置于65℃環(huán)境中溫浴15～30 min(期間可震蕩離心管2－3次)，然后移出.然后向離心管中加入130 μL DA Buffer，充分混勻，在冰盒中放置5min，再放入Sigma微量臺(tái)式離心機(jī)中14000 r離心3 min，待離心完成后用移液器吸取上層清液，將上清液轉(zhuǎn)移至一個(gè)已滅菌的1.5 mL離心管中.加入750 μL的 E Binding Buffer(使用前已按說(shuō)明加入了28 mL的無(wú)水乙醇)，上下顛倒混勻后將混合液轉(zhuǎn)移至Spin colum中，在高速離心機(jī)中6000 r離心1 min，并倒掉接液管中的液體，因?yàn)榇藭r(shí)的混合液體積大于750 μL，所以需要分2次進(jìn)行離心過(guò)柱.之后向Spin colum 中加入500 μL 的 G Binding Buffer，于10000r離心30s，并倒掉接液管中的液體.在Spin colum中加入600 μL的Wash Buffer(使用前已按說(shuō)明加入了37.8 mL的無(wú)水乙醇).于10000 r離心30 s，倒掉接液管中的液體，再重復(fù)此步驟一次.然后將Spin colum轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的1.5 mL的離心管中，向其中加入100 μL的Elution Buffer，放于室溫溫浴1 min后，最后于離心機(jī)中12000 r離心1 min，并棄掉Spin colum，此1.5 mL的離心管中的液體含有所需DNA，置于－20℃環(huán)境中保存?zhèn)溆?

1.2.2 DNA純度的檢測(cè)

隨機(jī)抽取已提取的樣品DNA進(jìn)行電泳檢測(cè)，每個(gè)隨機(jī)樣品取5μL于1.5%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，電流 180mA，電壓 180V，電泳15min，于凝膠成像系統(tǒng)中觀察DNA的降解情況及是否有RNA的影響.

PCR檢測(cè):

(1)所使用的引物購(gòu)買于上海生工生物公司，引物GSP的序列為

上游 5’－TCGCCGACGGATGATAATCG－3’下游5’－GAGTCACCCGCCCAAAGTTA － 3’

(2)反應(yīng)程序:共設(shè)置35個(gè)循環(huán)，步驟如下:

94℃(預(yù)變性)4 min→94℃(變性)1 min→54℃(復(fù)性)1 min→72℃(延伸)1.5 min→72℃(延伸)5 min→4℃環(huán)境中保存?zhèn)溆?/p>

(3)1.5%瓊脂糖凝膠電泳

用萬(wàn)分之一天平稱取適量的瓊脂糖，加入適量的已配置好的TAE溶液配制成1.5%凝膠，用微波爐將其沸騰一次后加入適量的EB，趁熱倒入插好梳子的制膠槽中，待凝膠凝固后加入PCR的產(chǎn)物，10 μL的樣品，并加入DNA Marker.

(4)電泳的結(jié)果在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行觀察和記錄.

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米絲黑穗冬孢子萌發(fā)情況的觀察

從溫箱中取出已培養(yǎng)3 d的玉米絲黑穗冬孢子，吸取適量的冬孢子滴于載玻片的中央，并滴幾滴無(wú)菌水后蓋上蓋玻片，至于電子顯微鏡下觀察其萌發(fā)狀態(tài).結(jié)果如下.

如圖1所示為冬孢子萌發(fā)前的狀態(tài)，在將其至于2%的葡萄糖溶液中，28℃黑暗培養(yǎng)3 d后，

圖1 冬孢子萌發(fā)前

圖2 冬孢子萌發(fā)后

其萌發(fā)狀態(tài)如圖2所示.說(shuō)明該絲黑穗冬孢子粉具有活性且能正常萌發(fā)，可以使用其對(duì)玉米進(jìn)行侵染.

2.2 DNA的提取與檢測(cè)

將采用試劑盒方法提取的DNA樣品，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果表明，用試劑盒所提取的樣本組織的DNA可以獲得高質(zhì)量的DNA，可以用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn).結(jié)果如圖3所示.

圖3 DNA凝膠檢測(cè)圖譜

2.3 PCR結(jié)果檢測(cè)

2.3.1 玉米葉片組織中絲黑穗病原菌的檢測(cè)

如圖4所示為帶病玉米植株葉片組織DNA的電泳結(jié)果，其中 M 是 DNA Marker，1～10，13～22均為黃早4未發(fā)病葉片組織DNA，11、23均為水(CK)，12、24均為玉米絲黑穗病菌的DNA.根據(jù)圖4可知，以玉米葉片DNA為模板進(jìn)行病菌PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)只擴(kuò)增出了3條與玉米絲黑穗病菌在同一范圍內(nèi)的譜帶，其中5號(hào)較為明顯，14號(hào)、21號(hào)均不明顯，病菌的檢測(cè)效率僅為15%.

圖4 瓊脂糖凝膠電泳圖譜(葉片)

2.3.2 以玉米根組織中絲黑穗病原菌的檢測(cè)

如圖5所示為帶病玉米植株根組織DNA的電泳結(jié)果，其中 M 是 DNA Marker，1 ～10，13 ～22均為黃早4未發(fā)病根組織DNA，11、23為水(對(duì)照)，12、24為玉米絲黑穗病菌的DNA.根據(jù)圖4可知，以玉米葉片DNA為模板進(jìn)行病菌PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增出了16條與玉米絲黑穗病菌在同一范圍內(nèi)的譜帶，僅有2號(hào)、3號(hào)、5號(hào)沒(méi)有擴(kuò)增出譜帶，13號(hào)不太明顯，病菌的檢測(cè)效率為80%.

圖5 瓊脂糖凝膠電泳圖譜(根)

3 結(jié)論與討論

通過(guò)選用玉米感病品種黃早4抽穗前期的葉片和根組織的DNA進(jìn)行提取，然后采用玉米絲黑穗病菌的特異性引物(GSP)進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè).結(jié)果發(fā)現(xiàn)以葉片的DNA為模板進(jìn)行PCR檢測(cè)時(shí)，其檢測(cè)效率僅僅為15%并不能對(duì)病苗是否帶有玉米絲黑穗病菌進(jìn)行有效的檢測(cè).而以根組織的DNA為模板進(jìn)行PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其檢測(cè)效率為80%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于葉片DNA的檢測(cè)效率.因此可以快速有效的對(duì)玉米幼苗在發(fā)病前期檢測(cè)出植株是否感染了玉米絲黑穗病.

在PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序中將退火溫度設(shè)置為54℃(根據(jù)引物GSP的特性設(shè)置了3個(gè)退火溫度梯度，分別是53℃、54℃、55℃，其余條件均不變的情況下發(fā)現(xiàn)，當(dāng)退火溫度為54℃時(shí)凝膠電泳檢測(cè)圖譜最為清晰)，35個(gè)循環(huán)時(shí)，以玉米絲黑穗病菌的特異性引物GSP對(duì)玉米絲黑穗病病苗中的病菌進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，其病菌的檢測(cè)率達(dá)到80%，因此可以用于快速且有效的在玉米絲黑穗病的發(fā)病前期對(duì)絲黑穗病菌進(jìn)行檢測(cè)，提早進(jìn)行防治，降低玉米絲黑穗病對(duì)玉米產(chǎn)量的影響.

在對(duì)玉米絲黑穗病進(jìn)行PCR研究時(shí)，通常提取的是玉米下部組織的DNA而不采用玉米葉片組織的DNA.通過(guò)查閱相關(guān)的文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，玉米絲黑穗病屬于幼苗期侵染的一種系統(tǒng)性的病害，絲黑穗的病原菌以散落在土壤中、混入到糞肥中或附著在玉米種子表面的冬孢子越冬，第二年成為主要的傳染源，其中以土壤帶菌侵染為主［3］.病原菌于種子萌發(fā)開(kāi)始從根莖、胚芽以及芽鞘侵染，并且在植株體內(nèi)形成菌絲，跟隨著植物向上生長(zhǎng).因此，在玉米植株的下部組織DNA中的病原菌濃度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于上部組織DNA中的病原菌濃度，而葉片中的病原菌數(shù)量要低于莖髓組織和根部組織甚至是沒(méi)有(如圖4所示)，因?yàn)椴≡z是選擇性的對(duì)植株的部位進(jìn)行侵染的，若選擇侵染葉片則不利于病原菌的繁殖［2］.玉米絲黑穗是一種比較復(fù)雜的病害，目前對(duì)它的發(fā)病機(jī)制了解還不是很透徹，而針對(duì)玉米品種的抗性而言，目前尚無(wú)絕對(duì)的免疫品種，抗病與不抗病是相對(duì)的概念［6］，只有做到早檢測(cè)、早發(fā)現(xiàn)、早防治才能將玉米絲黑穗病的危害降到最低，才能保證玉米的產(chǎn)量.隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，有關(guān)玉米分子遺傳學(xué)和基因組學(xué)的研究領(lǐng)域也在不斷向更深層面發(fā)展，隨著人們對(duì)玉米絲黑穗病的探索和研究越來(lái)越深入，將會(huì)有助于推進(jìn)玉米抗絲黑穗病育種取得新的研究進(jìn)展［7］.

［1］ 李玥瑩，董雪卉，許麗，等.玉米抗絲黑穗病基因RAPD分析［J］.生物技術(shù)，2006(5):16－18.

［2］ 邢躍先，吳鳳新，蔡鑫茹，等.葉片DNA對(duì)玉米絲黑穗病研究的可靠性［J］.玉米科學(xué)，2008(6):114－116.

［3］ 晉齊名.東北地區(qū)玉米、大豆重要病蟲害識(shí)別與防治.吉林:吉林科學(xué)技術(shù)出版社，2011.

［4］ 白壽發(fā)，高增貴，張小飛.玉米絲黑穗病菌PCR檢測(cè)［J］.雜糧作物，2010(4):294－296.

［5］ 李旭軍，劉西莉，劉鵬飛.玉米絲黑穗冬孢子萌發(fā)影響因子［A］.中國(guó)植物病理學(xué)會(huì).中國(guó)植物病理學(xué)會(huì)2004年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集［C］.中國(guó)植物病理學(xué)會(huì)，2004.

［6］ 邢躍先，檀國(guó)慶，李曉輝，等.玉米絲黑穗病侵染率與發(fā)病率關(guān)系的PCR檢測(cè)分析［J］.玉米科學(xué)，2007(6):111－113.

［7］ 曹士亮.玉米抗絲黑穗病遺傳育種研究進(jìn)展［J］.黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009(6):157－160.