王楠楠，郁建平

(貴州大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽550025)

二氫楊梅素［(2R，3R)－3，5，7－三羥基 －2－(3，4，5－三羥基苯基)苯并二氫吡喃－4－酮，Dihydromyricetin，DMY］是多酚羥基雙氫黃酮醇，屬黃酮類化合物，是食品新資源—藤茶中的主要活性成分［1］，二氫楊梅素的結(jié)構(gòu)式如下:

隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化的擴大，農(nóng)畜的抗生素類和激素類添加劑的用量不斷加大。這些藥物在增強農(nóng)畜自身生產(chǎn)性能和抵抗力的同時也帶來了嚴重的負面效應(yīng):長期使用抗生素會導(dǎo)致其自身免疫力下降，病菌產(chǎn)生抗藥性。因此，尋找新型的天然藥物成為近年來研究的熱點。二氫楊梅素具有天然性，低副作用且無抗藥性［2－3］，其獨特的作用是代替抗生素和激素類藥物的理想選擇。藥理研究表明，DMY能對抗去腎上腺素和高K+所致的兔胸主動脈條的收縮反應(yīng)及顯著擴血管和鈣阻滯作用［4］，具有消炎、抑菌［5－8］、止咳、鎮(zhèn)痛、消脂及抗脂質(zhì)過氧化等功效［9－10］，因此，DMY具有廣泛的應(yīng)用前景。

二氫楊梅素水溶液極不穩(wěn)定［11］，極易被多種氧化劑氧化及發(fā)生自身的氧化而轉(zhuǎn)化為無活性的物質(zhì)。此外，溶液的pH對產(chǎn)品穩(wěn)定性也至關(guān)重要。為更快速、有效的發(fā)揮DMY的藥理作用，試驗以吐溫－80為助溶劑，加入適量的抗氧化劑并調(diào)節(jié)適宜的pH來保證產(chǎn)品的穩(wěn)定性，成功地篩選出了二氫楊梅素注射劑處方，以便加快二氫楊梅素在畜牧業(yè)中的推廣應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 二氫楊梅素為實驗室自制，經(jīng)HPLC分析純度為90%;二氫楊梅素標準品(上海源葉生物科技有限公司)。

1.1.2 儀器與試劑 高效液相色譜分析儀(美國VARIAN公司)，303—5電子秤(上海精科實業(yè)有限公司)，pH計(上海天達儀器有限公司)，恒溫水浴鍋(上海亞榮生化儀器廠)，TU－1901雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)，抗壞血酸(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，)，亞硫酸氫鈉(天津恒興化學(xué)試劑制造有限公司)，焦亞硫酸鈉(天津恒興化學(xué)試劑制造有限公司)，吐溫－80(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)為分析純，甲醇(北京北化化學(xué)品有限責(zé)任公司)、磷酸(深圳市恒迪源潤達實業(yè)有限公司)為色譜純。

1.2 方法

1.2.1 標準曲線的繪制 準確稱取二氫楊梅素標準品3.8 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻。分別吸取0 mL，2 mL，4 mL，6 mL，8 mL，10 mL標準品溶液，置于六個10 mL容量瓶中，分別加甲醇至10mL，搖勻，用0.45μm濾器過濾即配得濃度分別為0μg/mL、15.2μg/mL、30.4 μg/mL、45.6μg/mL、60.8μg/mL、76μg/mL的標準品溶液。將配置好的各濃度梯度的標準樣品溶液分別進樣.測定峰面積，以峰面積(y)為縱坐標，以對應(yīng)的二氫楊梅素的質(zhì)量(x)為橫坐標，繪制標準曲線，建立回歸方程。結(jié)果見圖1。

1.2.2 助溶劑用量的選擇 分別秤取0.18 g二氫楊梅素于5個100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，于60℃溫水中加熱10 min，分別加入0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL吐溫 －80，繼續(xù)加熱20 min，密封，于4℃暗處放置24 h。將溶解有DMY的6支容量瓶置于遮光板邊緣處，分別在黑色和白色背景下，手持供試品頸部輕輕旋轉(zhuǎn)和翻轉(zhuǎn)容器使藥液中可能存在的可見異物懸浮(但應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡)，輕輕翻搖后即用目檢視，重復(fù)3次檢查澄明度。分別從各個容量瓶中量取溶液0.15 mL置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，在290 nm的波長處測定紫外吸光度，測定結(jié)果見表3。

1.2.3 pH的選擇 分別取0.18 g二氫楊梅素于5個100 mL容量瓶中，加入0.4 mL吐溫－80使其溶解，分別調(diào)節(jié)pH為1.5、2.5、3.5、4.5、5.5，密封，于暗處放置7天，用高效液相色譜分別測其含量。所得結(jié)果見表4。

1.2.4 抗氧劑的選擇 擬選擇抗壞血酸、亞硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉為抗氧劑，如表5所示，設(shè)計四個處方，分別配置成100 mL澄清溶液，密封，于4℃暗處放置10天，高效液相測其DMY含量。

1.2.5 體外抑菌試驗［12］

(1)藥敏試驗:分別取二氫楊梅素(90%)1.4 g、1.6 g、1.8 g，用100 mL 75%乙醇溶解，配成三種濃度的藥液。將腸產(chǎn)毒型大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和沙門氏菌接種于普通瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h，挑取典型菌落接種于新鮮肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18 h，備用。分別取待測的各種細菌于普通肉湯培養(yǎng)基，用無菌棒均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂平板上，待干燥后用鑷子夾住藥敏紙片于瓊脂表面，一個平皿貼3片含樣品藥液的濾紙片，呈正三角形。平皿中間貼一個用76%乙醇浸泡同樣長時間的濾紙片，作為對照。每個平板做3個重復(fù)，于37℃培養(yǎng)24 h后用直尺測量抑菌圈直徑。實驗結(jié)果見表6。

(2)最低抑菌濃度(MIC)試驗:取6支試管，于每一支試管內(nèi)加入培養(yǎng)液2 mL(滅菌121℃，30 min)。吸取2 mL藥液(二氫楊梅素濃度為8，0 g/L)到第1管內(nèi)，充分混勻后吸出2 mL到第2管中，依次稀釋到第6管。第6管充分混勻后吸出2 mL混合液丟棄。再向每一管內(nèi)分別加菌懸液0.05 mL(菌液濃度106～107 cfu/mL)搖勻后細菌置37℃培養(yǎng)24 h取出觀察。以能抑制細菌生長繁殖的藥液最高稀釋度為該藥的最低抑菌濃度。實驗結(jié)果見表7。

(3)最低殺菌濃度(MBC)試驗:將上述稀釋度在MIC以前(包括MIC)的各菌藥混合管取0.1 mL脂平板上，用無菌玻璃刮鏟涂抹均勻后，細菌于37℃培養(yǎng)24 h，取出觀察結(jié)果，以仍沒菌生長的最高藥物稀釋度為該藥的最低殺菌濃度。實驗結(jié)果見表8。

2 結(jié)果與分析

2.1 回歸方程的建立

利用高效液相色譜儀(HPLC)對制備的注射劑進行含量測定［13］。色譜柱為ODSC18柱(150 mm×4.6 mm，5μm);柱溫為室溫;流動相為甲醇 －0.2%磷酸溶液25∶75;每次進樣10μL，體積流量為1.0 mL/min;檢測波長為290 nm［14－15］。保留時間t=14.942，在本實驗色譜條件下，二氫楊梅素色譜峰峰形對稱，無干擾。結(jié)果如圖1所示。回歸方程為:y=30.783x+7.057 1，R2=0.999 8，線性范圍為0.015～0.08 mg。

圖1 二氫楊梅素標準曲線Fig.1 The standard curve of dihydromyricetin

2.2 精密度試驗

配制60μg/mL濃度的標準品溶液重復(fù)進樣6次，記錄峰面積，結(jié)果見表1。

從實驗結(jié)果得RSD=0.68%，說明方法精密度良好。

表1 精密度試驗Tab.1 The precision experiment

2.3 穩(wěn)定性試驗

配制60μg/mL濃度的標準品溶液，每隔1 h時測1次，測5次，記錄峰面積，結(jié)果見表2。

表2 穩(wěn)定性試驗Tab.2 The stability test

從實驗結(jié)果得RSD=1.13%，該法穩(wěn)定性良好。

2.4 助溶劑的用量選擇

二氫楊梅素在不同濃度的吐溫－80中的溶解情況如表3所示。

從表3可以看出，吐溫－80用量在0.4 mL時的溶液澄清度最好且吸光度最大，說明溶解的DMY的量最多。因此對于DMY，吐溫－80的濃度為4μL/mL時具有較好的助溶效果。

2.5 pH對制劑穩(wěn)定性的影響

將放置7天后的不同pH的溶液經(jīng)0.45μm濾器過濾后分別進樣，分別測其峰面積，結(jié)果如表4所示。

表3 DMY在不同量的助溶劑中的溶解情況Tab.3 The dissolution of DMY in different amounts of cosolvent

表4 pH對DMY穩(wěn)定性的影響Tab.4 The influence of p H on stability of DMY

由表4可知，溶液的pH為3.5時，峰面積最大，即DMY的含量最多，因此選擇pH3.5作為最適pH。經(jīng)回歸方程計算得，pH=3.5時二氫楊梅素的含量為131.3 mg/100 mL，樣品中二氫楊梅素含量約為90%，即有近20%的DMY在放置過程中氧化分解。

2.6 抗氧劑對制劑穩(wěn)定性的影響

分別將放置10天的四個處方藥液經(jīng)0.45μm濾器過濾后進樣，測其峰面積，實驗結(jié)果如表5所示:

表5 抗氧劑對DMY穩(wěn)定性的影響Tab.5 The influence of antioxidant on stability of DMY

由實驗結(jié)果可知，處方2的峰面積最大，經(jīng)回歸方程計算得，二氫楊梅素含量為159.2 mg/100 mL，即在放置過程中僅有1.75%的二氫楊梅素發(fā)生氧化分解，抗壞血酸在該處方中的抗氧化活性十分顯著。

2.7 DMY藥敏試驗

由表6可知，二氫楊梅素對上述細菌均有很好的抑制作用，體外抑菌效果明顯，其中對大腸桿菌的抑菌效果最明顯。

表6 DMY對供試菌種的抑制效果Tab.6 The inhibition effect of DMY on selecte d strains

2.8 DMY最低抑菌濃度

由表7可知，腸產(chǎn)毒性大腸桿菌的MIC值為:2.018 g/L，沙門氏菌和金葡菌的MIC值為1.01 g/L，枯草芽孢桿菌的MIC值為0.5044 g/L。

表7 DMY最低抑菌濃度Tab.7 The minimal inhibitory concentration of DMY

2.9 最低殺菌濃度

由實驗數(shù)據(jù)可得:腸產(chǎn)毒性大腸桿菌和腸出血性大腸桿菌的最低殺菌濃度為4.034 g/L，沙門氏菌和金葡菌的為1.01 g/L，枯草芽孢桿菌的大于4.035 g/L。由表7和表8知，二氫楊梅素具有廣譜抑菌、殺菌的效果，其最低抑菌濃度和最低殺菌濃度較低，這些指標顯示了其作為注射劑的較好的應(yīng)用前景。

表8 DMY最低殺菌濃度Tab.8 The minimal bactericidal concentration of DMY

2.10 最佳處方驗證

精密稱取二氫楊梅素1.8g，置1 000 mL容量瓶中，加800 mL蒸餾水，60℃水浴加熱10 min后加入4 mL吐溫－80和1 g抗壞血酸，繼續(xù)熱20 min使其溶解，加入0.5 g活性炭振搖30 min，用0.45 um微孔濾膜過濾，繼續(xù)加蒸餾水至刻度，調(diào)節(jié)pH為3.5，于4攝氏度冰箱中保存30天，發(fā)現(xiàn)溶液色澤、澄清度等基本沒有變化。注射劑中二氫楊梅素的含量為0.162 mg/mL。

3 討論

二氫楊梅素作為藤茶中最主要的黃酮類物質(zhì)，在諸多領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，但其作為抗菌注射劑的應(yīng)用所見不多。本實驗重在篩選二氫楊梅素注射劑的制備處方，考慮到二氫楊梅素的穩(wěn)定性差又難溶于水，所以用乳化劑吐溫－80作為助溶劑，以抗壞血酸作為抗氧化劑。實驗結(jié)果證明兩者合用效果很好，大大減少了DMY在放置過程中的損耗。該處方可作為家畜(如豬、牛等)和家禽(如雞等)的抗菌注射劑，尤其對豬腸道致病菌有很好的抑制和殺滅作用。

［1］楊志堅，袁弟順，陳凌華，等.藤茶中二氫楊梅素的研究概況［J］.中國茶葉加工，2010，1:20－22.

［2］徐運杰，范志勇，方熱軍.二氫楊梅素在畜牧業(yè)應(yīng)用中的研究［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2007，34(17):22－24.

［3］李武昌，周俊萍，程 璇，等.二氫楊梅素在牧業(yè)中的研究進展與應(yīng)用前景［J］.中國畜禽種業(yè)，2009，9:143－145.

［4］周雪仙，周天達.二氫楊梅樹皮素對兔胸主動脈條平滑肌收縮反應(yīng)的影響［J］.現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，1997，14(2):8－11.

［5］陳 帥，郁建平.藤茶總黃酮抗炎及抑菌作用的實驗研究［J］.貴陽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2013，15(1):40－42.

［6］薛 慧.恩施來鳳藤茶微量元素的分析及其保健功能探討［J］.廣東微量元素學(xué)，2004，11(8):56－58.

［7］張友勝，楊偉麗，熊皓平.顯齒蛇葡萄基本成分研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2001，13(5):46－48.

［8］熊皓平，何國慶，楊偉麗，等.顯齒蛇葡萄生化成分分析［J］.中國食品學(xué)報，2004，3:68－71.

［9］鐘正賢，覃潔萍，周桂芬，等.廣西瑤族藤茶中雙氫楊梅樹皮素的藥理研究［J］.中國民族醫(yī)藥雜志，1998，4(3):42－44.

［10］何桂霞，楊偉麗，裴 剛，等.二氫楊梅素抗脂質(zhì)過氧化作用的研究［J］.中國中藥雜志，2003，28(12):1 188－1 190.

［11］王丹，郁建平，劉 灝.藤茶二氫楊梅素抗氧化活性研究［J］.山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報，2013，32(3):243－246.

［12］嚴贊開，徐曉齡，梁明春.幾種二氫楊梅素酯的抑菌試驗［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，4:313－314.

［13］楊明意，王立興.高效液相色譜法測定健目膠囊中二氫楊梅素的含量［J］海峽藥學(xué)，2009，21(8):35－37.

［14］朱 哲，楊悟新，強烈應(yīng)，等.二氫楊梅素研究進展［J］.武警醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2011，20(7):600－604.

［15］潘人琦，郁建平.二氫楊梅素解酒作用的研究［J］.山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報，2012，31(3):30.