李永捷，董 旋，趙德剛，3*

(1.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新省部共建教育部重點實驗室，貴州貴陽550025;2.貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究院貴州省農(nóng)業(yè)生物工程重點實驗室，貴州 貴陽550025;3.貴州大學(xué)綠色農(nóng)藥與農(nóng)業(yè)生物工程國家重點實驗室培養(yǎng)基地，貴州 貴陽550025)

杜仲(Eucommia ulmoides)，是我國特有的一種名貴中藥材。杜仲入藥，在《神農(nóng)本草經(jīng)》和《本草綱目》中早有記載，主要用于治療腎虛腰痛，筋骨乏力，胎動不安和高血壓癥?，F(xiàn)代藥物化學(xué)和藥理學(xué)研究將杜仲的藥用活性成分分為:木脂素類、環(huán)烯醚萜類、甾萜類、酚酸類、脂肪酸類、黃酮類和多種維生素及內(nèi)酯類［1］，其中研究最多、結(jié)構(gòu)最清楚、成分最明確的當(dāng)屬杜仲木脂素類化合物。目前杜仲中分離、鑒定的木脂素有26個、倍半木脂素有2個，共計28個，其中16個為糖苷結(jié)構(gòu)，如具有抗腫瘤作用的丁香脂素雙糖苷、具有雙向血壓調(diào)節(jié)作用的松脂醇雙糖苷等［2-3］。相關(guān)藥理研究發(fā)現(xiàn)杜仲木脂素類化合物的糖苷結(jié)構(gòu)尤為重要，如松脂醇雙糖苷的母核松脂醇沒有糖苷結(jié)構(gòu)時不具備血壓調(diào)節(jié)能力［4］，而多種木脂素類化合物對cAMP磷酸二酯酶抑制活性的研究結(jié)果顯示活性最高的是木脂素雙糖苷，其次是單糖苷，部分木脂素苷元甚至不表現(xiàn)抑制活性［5］。

木脂素(Lignans)由兩分子苯丙素類單體經(jīng)氧化酶催化聚合而成，構(gòu)成杜仲木脂素的苯丙素類單體主要是肉桂酸(Cinnamic acid)衍生物單體木質(zhì)醇(Monolignols):松柏醇、芥子醇和對香豆醇。植物合成的苯丙氨酸經(jīng)苯丙素生物合成途徑(Phenylpropanoid biosynthesis)生成多種苯丙素類單體，木質(zhì)醇除參與木脂素的合成之外更主要參與植物木質(zhì)化矩陣構(gòu)建合成木質(zhì)素(Lignins)，是組成植物次生細(xì)胞壁的主要成分［6］，且研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)合成的單體木質(zhì)醇更多是以其糖苷形式儲存于液泡中［7］。

植物的糖基轉(zhuǎn)移酶(Glucosyltransferase，GT，EC 2.4.x.y)是植物中一大類催化糖苷取代反應(yīng)的酶，該類酶以UDP-Sugar為糖基供體，特異性識別糖基受體，催化特定位點的糖基化反應(yīng)合成糖苷，是植物次生代謝重要的結(jié)構(gòu)修飾酶之一［8］。糖苷化是天然藥物的重要修飾反應(yīng)，能夠顯著增強小分子藥物的水溶性。目前，從藥用植物中分離天然藥物的糖基轉(zhuǎn)移酶基因已成為新藥合成與老藥糖基化改造的重要研究方向之一［9］。本研究從杜仲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫篩選出一個糖基轉(zhuǎn)移酶基因的片段，其注釋信息為松柏醇糖基轉(zhuǎn)移酶基因(Coniferin alcohol Glucosyl Transferase，CGT)，使用SMART RACE技術(shù)從杜仲中克隆了該基因的cDNA序列，(Eucommia ulmoides Coniferin alcohol Glucosyl Transferase，EuCGT1)。將克隆獲得的EuCGT1基因構(gòu)建植物表達(dá)載體pSH-35S-EuCGT1，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法遺傳轉(zhuǎn)化普通煙草(Nicotiana tabacum L.)品種長脖黃，為研究該基因功能以及杜仲木質(zhì)醇苷、木脂素糖苷的生物合成調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

杜仲新生幼枝的樹皮取自種植于本實驗室植物試驗示范基地的7月份杜仲雌株，置于液氮中備用。普通煙草(Nicotiana tabacum L.)種子由本實驗室保存。

1.1.2 質(zhì)粒及菌株

基因克隆初始載體pGEM-T Easy Vector Systems購自Promega公司，克隆菌株為大腸桿菌菌株DH5α由本實驗室保存;植物表達(dá)初始載體pSH737和植物表達(dá)菌株根癌農(nóng)桿菌菌株LBA 4404由本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 轉(zhuǎn)錄組序列篩選及引物合成

檢索本實驗室前期構(gòu)建的杜仲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，依據(jù)KEGG比對整合結(jié)果，篩選出注釋信息為松柏醇糖基轉(zhuǎn)移酶(CGT)編碼基因的序列片段6條，使用SerialCloner Ver.2.6.1進(jìn)行BLAST分析，最終選取長度為600bp的CL13624.Contig_4_All為模板設(shè)計RACE特異性引物(gene-specific primers，GSPs)，RACE擴(kuò)增后測序并拼接，依照拼接結(jié)果設(shè)計全長正向引物(CGT Forward，CGTF)，配合嵌套式通用引物(Nested Universal Primer，NUP)對CGT全長進(jìn)行擴(kuò)增(所有引物見表1)。

表1 PCR所用引物Tab.1 Primers used for full－length cloning of EuCGT1

1.2.2 杜仲皮RNA的提取

取10 cm杜仲雌株新生棕色皮枝條(樹皮約150 mg)，液氮冷凍后刮去外皮層，沿內(nèi)皮層將韌皮部與木質(zhì)部分離，研磨至粉狀。按照Omega公司困難樣本方案進(jìn)行，增加兩次無水乙醇洗滌，降低鹽殘留對RACE PCR反應(yīng)的干擾。提取的杜仲皮總RNA保存于-80℃?zhèn)溆谩NA 4μL，加入甲醛5μL、10×Loading Buffer 1μL，65℃水浴15 min變性，使用1.2%變性瓊脂糖凝膠(含0.98%甲醛)電泳檢測RNA提取質(zhì)量。

1.2.3 cDNA第一條鏈合成

參照Clontech SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit User Manual，反轉(zhuǎn)錄酶使用Super-ScriptTMIII Reverse Transcriptase，進(jìn)行cDNA第一條鏈合成。合成的5′-RACE-Ready cDNA和3′-RACE-Ready cDNA用Tricine-EDTA Buffer 20 μL溶解，-20℃保存。

1.2.4 5’－RACE和3’－RACE擴(kuò)增

參照Clontech SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit User Manual，使用KOD-Plus-Neo DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增。使用GSP1與通用引物(Universal Primer A Mix，UPM)對5’-RACE cDNA進(jìn)行擴(kuò)增;使用GSP2與UPM對3’-RACE cDNA進(jìn)行擴(kuò)增。PCR管中順序加入下列成分，建立50μL反應(yīng)體系:PCR-Grade Water 28μL，10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5μL，dNTPs(10 mM)5μL，MgSO4(25 mM)3μL，UPM(10×)5 μL，GSP1 or GSP2(10μM)1μL，5’-RACE or 3’-RACE cDNA 2μL，KOD-Plus-Neo(1U/μL)1μL，混勻后瞬時離心，全過程冰浴中進(jìn)行。使用熱啟動Touchdown PCR反應(yīng)程序:90℃，30 sec，放入反應(yīng)管;94℃，2 min;98℃20 sec，72℃，80 sec，5 cycles;98℃20 sec，70℃80 sec，5 cycles;98℃20 sec，68℃80 sec，35 cycles;68℃7 min;4℃終止反應(yīng)。取5μL PCR產(chǎn)物，1.6%瓊脂糖凝膠電泳檢測;使用Omega公司的E.Z.N.A.TMGel Extraction Kits回收純化擴(kuò)增條帶。

1.2.5 擴(kuò)增片段克隆及序列分析

純化產(chǎn)物Taq DNA聚合酶末端加A尾，70℃孵育45min。加A尾產(chǎn)物連接至pGEM?-T Easy Vector載體上，參照Promega technical manual體系:2×Rapid Ligation Buffer 5μL，pGEM?-T Easy Vector(50ng)1μL，PCR product 3μL，T4 DNA Ligase(3 Weiss units/μL)1μL混勻4℃孵化過夜，室溫連接30 min。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌(DH5α)，以Amp和藍(lán)白斑篩選陽性菌落克隆，E.Z.N.A.TMPlasmid Mini Kits提取陽性大腸桿菌質(zhì)粒，送北京諾賽基因組研究中心有限公司測序。

1.2.6 構(gòu)建植物表達(dá)載體

以初始載體pSH737(圖1b)為基礎(chǔ)，設(shè)計并構(gòu)建pSH-35S-EuCGT1植物表達(dá)載體(圖1c)。根據(jù)測序結(jié)果選擇上游酶切位點為XbaI，下游酶切位點為KpnI，設(shè)計含有酶切位點的EuCGT1擴(kuò)增引物(表2)，擴(kuò)增的EuCGT1與pSH737均進(jìn)行雙酶切并純化，使用DNA連接酶連接粘性末端(圖1)，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌(DH5α)，使用Kan 100 mg/L篩選陽性克隆，提取重組質(zhì)粒使用XbaI和KpnI進(jìn)行雙酶切驗證。

酶切驗證結(jié)果呈陽性的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株LBA4404感受態(tài)細(xì)胞，以Kan 100 mg/L、Rif 20 mg/L篩選農(nóng)桿菌陽性菌株，使用表2引物對陽性菌株進(jìn)行菌落PCR檢測，PCR結(jié)果呈陽性的農(nóng)桿菌菌株擴(kuò)大培養(yǎng)-80℃保種。

表2 EuCGT1植物表達(dá)載體擴(kuò)增引物Tab.2 Primers used for EuCGT1 detection in plant expression vector

圖1 植物表達(dá)載體pSH-35S-EuCGT1構(gòu)建過程Fig.1 Construction of pSH-35S-EuCGT1 plant expression vector

1.2.7 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法遺傳轉(zhuǎn)化煙草

使用10ml含Kan 100 mg/L、Rif 20 mg/L的液體YEP，28℃200 rpm，活化培養(yǎng)pSH-35S-Eu-CGT1植物表達(dá)載體農(nóng)桿菌菌株LBA4404至OD600為0.7，取活化后的菌按1%接種量于YEP液體培養(yǎng)基(Kan 100 mg/L、Rif 20 mg/L)擴(kuò)大培養(yǎng)，至菌液OD600約為0.5～0.7，取菌液50 mL室溫6 000 rpm離心10 min，菌體用重懸液重懸，至OD600為0.6。轉(zhuǎn)pSH737初始載體的農(nóng)桿菌菌株LBA4404采用相同方法制備重懸菌液，作為煙草遺傳轉(zhuǎn)化的空白對照組。

普通煙草種子使用無菌水萌發(fā)后移栽花盆內(nèi)，置于植物生長室生長3個月用于實驗取材。剪取完全伸展且沒有損傷的幼嫩煙草葉片為外植體，流水沖洗30 min后轉(zhuǎn)入超凈工作臺操作。使用75%酒精浸泡消毒30 s后用無菌水清洗3次;使用0.1%HgCl2溶液浸泡消毒8 min后用無菌水清洗5次以上，直至無菌水洗液不再出現(xiàn)泡沫;漂洗干凈的葉片用無菌濾紙吸去表面水分將經(jīng)過消毒處理的煙草葉片切去葉柄及邊緣，葉片切成1 cm見方的小片，用配制好的重懸菌液浸泡煙草葉片，其間不斷搖動。侵染5 min后取出葉片，用無菌濾紙吸去表面多余菌液。葉片密布接種于共培培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)3 d。

共培養(yǎng)3天后的煙草葉片間隔1.5 cm接種于含kan的篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選培養(yǎng)，每兩周更換一次篩選培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)。約20天后有抗性愈傷形成，不斷繼代的抗性愈傷逐漸分化出抗性芽，待抗性芽長至約1cm左右時，切下抗性芽置于含kan的生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，至抗性芽長大成苗根系生長較發(fā)達(dá)后，對抗性苗煉苗處理3天，將植株從培養(yǎng)罐中取出洗凈根系附著的培養(yǎng)基并栽至花盆中生長。

1.2.8 轉(zhuǎn)基因煙草的鑒定

植物表達(dá)載體pSH-35S-EuCGT1中含有GUS報告基因，可使用GUS組織化學(xué)染色法可以快速鑒定轉(zhuǎn)基因植株。剪取抗性煙草植株新生幼葉浸泡于GUS染色液中，37℃恒溫培養(yǎng)箱中放置過夜，移至乙醇溶液中浸泡直至綠色完全脫去，在體視鏡下觀察。

為進(jìn)一步確認(rèn)所獲得的煙草抗性植株是轉(zhuǎn)入目的基因的轉(zhuǎn)基因植株，取GUS組織化學(xué)染色呈陽性的生長良好的轉(zhuǎn)基因抗性煙草植株，參照TIANGEN公司的基因組DNA提取試劑盒提取抗性煙草的基因組DNA用于檢測。

提取的抗性煙草基因組DNA使用表2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 杜仲總RNA的提取

所有凝膠成像結(jié)果使用Bio-Rad公司Image Lab(Ver.5.0)軟件進(jìn)行條帶分析。提取的杜仲皮總RNA 1.2%瓊脂糖變性膠電泳結(jié)果(圖1)。圖中28S和18S條帶清晰，且28S條帶的寬度與亮度約為18S條帶的兩倍，說明RNA較為完整。OD值測定結(jié)果:OD260/280=1.93、OD260/OD230=1.83，說明RNA樣品純度較高，鹽離子去除程度較高，符合RACE擴(kuò)增要求。

圖2 杜仲總RNAFig.2 Total RNA isolated from Eucommia ulmoides

2.2 杜仲EuCGT1基因克隆

分別使用引物GSP1和GSP2與UPM組合進(jìn)行TouchDown PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物1.6%瓊脂糖凝膠電泳檢測，顯示GSP1擴(kuò)增條帶測序結(jié)果為1 432 bp(圖3a)，GSP2擴(kuò)增條帶測序結(jié)果為535 bp(圖3b)。兩組擴(kuò)增中有287 bp重復(fù)區(qū)域，與設(shè)計相符。

圖3 cDNA擴(kuò)增:a.5’-RACE;b.3’-RACE;c.EuCGT1全長擴(kuò)增Fig.3 The cDNA fragment amplification:a.5’-RACE;b.3’-RACE;c.EuCGT1 full-length

根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計的全長擴(kuò)增引物CGTF與NUP組合，以3’-RACE cDNA第一條鏈為模板擴(kuò)增杜仲松柏醇糖基轉(zhuǎn)移酶CGT的全長序列。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，所得條帶在1 500 bp以上(圖3c)。實際擴(kuò)增大小為1 616 bp，與RACE拼接結(jié)果一致。將該基因命名為EuCGT1。

2.3 EuCGT1序列分析

EuCGT1實際克隆長度為1 583 bp，起始密碼子ATG位于10 bp處，終止密碼子TGA位于1 473 bp處，polyA尾長28 bp，加尾信號AATAAA位于1 534～1 539 bp，推測開放閱讀框長1 464 bp，編碼487個氨基酸及一個終止密碼子，全長序列及推測氨基酸順序見圖4。NCBI進(jìn)行EuCGT1核酸序列blastn比對，結(jié)果顯示同源性最高的是草莓(67%，F(xiàn)ragaria x ananassa，ID:82880417)和甜橙(72%，Citrus sinensis，ID:102628347)的UDP-葡萄糖糖基轉(zhuǎn)移酶-6(UDP-glucose glucosyltransferase-6，GT6);NCBI進(jìn)行EuCGT1氨基酸序列blastp比對，結(jié)果顯示同源性最高的是葡萄(58%，Vitis vinifera，XP_002263661.1)和甜橙(58%，Citrus sinensis，XP_006481379.1)的UDP-葡萄糖類黃酮3-O-糖基轉(zhuǎn)移酶-6(UDP-glucose flavonoid 3-O-glucosyltransferase-6)。序列分析結(jié)果推測EuCGT1為糖基轉(zhuǎn)移酶家族基因。

圖4 EuCGT1全長序列及推測的氨基酸Fig.4 EuCGT1 sequences of nucleotide and its deduced amino acid

2.4 蛋白EuCGT1結(jié)構(gòu)分析

使用DNAssist Ver.2.2對EuCGT1蛋白質(zhì)理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測，相對分子量為54kD，等電點pI為5.2。使用Center of Biological Sequence Analysis整合的多款在線分析工具對EuCGT1氨基酸序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析與預(yù)測。SignalP 4.1 Server信號肽分析結(jié)果顯示EuCGT1中不含真核信號肽;TMHMM Server v.2.0跨膜結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示Eu-CGT1全部氨基酸均在膜外，沒有膜內(nèi)或穿膜結(jié)構(gòu)。根據(jù)上述兩項結(jié)果初步推測EuCGT1的表達(dá)位置在細(xì)胞質(zhì)。NetSurfPver.1.1和PSIPRED v.2.5在線聯(lián)合分析對氨基酸序列表面親和性及二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，親和性預(yù)測結(jié)果顯示EuCGT1中有46%的氨基酸(224個)位于蛋白表面(Exposed)，有54%(263個)位于蛋白內(nèi)部(Buried);二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示EuCGT1中50.3%的氨基酸(245個)參與構(gòu)成α-螺旋(α-Helix)，37.17%(181個)構(gòu)成無規(guī)則卷曲(Random Coil)，β-片層(β-Strand)結(jié)構(gòu)最少，占12.53%(61個)。聯(lián)合分析結(jié)果顯示暴露在外的氨基酸多為α-螺旋和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，而β-片層幾乎全部都被包裹在Eu-CGT1蛋白結(jié)構(gòu)內(nèi)部。聯(lián)合分析結(jié)果見圖5。

圖5 NetSurfP和PSIPRED分析EuCGT1氨基酸序列Fig.5 NetSurfP-PSIPRED analysis of the amino acid sequence of EuCGT1.

使用Conserved Domains Database比對EuCGT1氨基酸序列，結(jié)果顯示EuCGT1與GT1糖基轉(zhuǎn)移酶(GT1_Gtf_like，PSSM:CD03784，以 下 簡 稱CD03784)同源性較高。CD03784以TDP-葡萄糖為糖基供體，對萬古胺(vancosamine)進(jìn)行糖基化修飾。EuCGT1與CD03784經(jīng)同源比對篩選出相似的保守結(jié)構(gòu)域(見圖6)，涉及的核心氨基酸有14個，6個位于糖基供體結(jié)合位點，5個位于萬古胺結(jié)合位點，3個位于催化位點。保守結(jié)構(gòu)域的14個氨基酸中EuCGT1與CD03784在糖基供體結(jié)合位點有1個氨基酸差異，在萬古胺結(jié)合位點有3個氨基酸差異，催化活性中心的保守結(jié)構(gòu)域相同。

圖6 EuCGT1保守結(jié)構(gòu)域比對結(jié)果Fig.6 Alignment of the conserved domains of EuCGT1

CDD的比對結(jié)果顯示，以2ACV蛋白三級結(jié)構(gòu)為模體對EuCGT1和CD03784進(jìn)行3D同源建模，比較EuCGT1與cl10013的三級結(jié)構(gòu)和活性中心(圖7)。從圖中核心氨基酸差異位點可以看出，EuCGT1與CD03784在特異性底物(萬古胺)結(jié)合位點上差異明顯，說明EuCGT1不能結(jié)合萬古胺，而松柏醇的特異性結(jié)合位點目前尚未見報道，故不排除EuCGT1催化松柏醇糖基化的可能性;而糖基供體結(jié)合位點僅有1個氨基酸差異(C圖藍(lán)色箭頭所示)，說明EuCGT1能夠結(jié)合糖基供體;整體三級結(jié)構(gòu)可以看出，EuCGT1的氨基酸骨架符合NDP-糖基轉(zhuǎn)移酶的特征，能夠折疊形成相應(yīng)的活性催化中心和底物結(jié)合位點。

使用EuCGT1蛋白質(zhì)序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹:植物中已知的松柏醇糖基轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列主要存在兩組Motif:Glycosyl transferase family 1和Glycosyltransferase family 28 C-terminal domain，這與花青素/原花青素糖基轉(zhuǎn)移酶家族的核心Motif相同。從NCBI中檢索植物中報道的CGT氨基酸序列，使用ClustalX2 for Mac將檢索獲得的具有代表性的氨基酸序列與EuCGT1氨基酸序列進(jìn)行比對，使用MEGA5.2.2構(gòu)建NJ進(jìn)化樹，結(jié)果顯示(圖8):Eu-CGT1與其他植物CGT無法聚類，而是與(Genlisea aurea)的Lignan UGT(partial)聚為一類，說明杜仲EuCGT1在進(jìn)化歷程上與這些植物的CGT親緣性較遠(yuǎn)，螺旋貍藻屬植物歸于菊亞綱(Asteridae)，推測杜仲的EuCGT1蛋白在進(jìn)化過程中與菊亞綱植物CGT親緣性較近。

圖7 EuCGT1 3D模型及催化核心氨基酸殘基比較Fig.7 Alignment of amino acid residues of active sites in 3D structure of EuCGT1

圖8 EuCGT1蛋白全長氨基酸序列NJ樹構(gòu)建Fig.8 Neighbor joining tree of full length amino acid sequence of EuCGT1

2.5 植物表達(dá)載體鑒定

大腸桿菌中提取的重組質(zhì)粒使用XbaI和KpnI進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果見圖9a。酶切結(jié)果顯示陽性菌落中提取的質(zhì)粒經(jīng)雙酶切能獲得一條大小在1 500 bp左右的條帶，是說明EuCGT1正確連入pSH737的多克隆位點。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，農(nóng)桿菌陽性菌株的菌落PCR結(jié)果見圖9b，結(jié)果顯示3、4號菌株均擴(kuò)增獲得了1 500 bp左右的條帶，說明pSH-35S-EuCGT1植物表達(dá)載體構(gòu)建完成并已轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中。

圖9 植物表達(dá)載體鑒定:a.重組質(zhì)粒雙酶切鑒定;b.農(nóng)桿菌LBA4404菌落PCRFig.9 Detection of dicot expression vector

2.6 轉(zhuǎn)基因煙草鑒定

經(jīng)農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化獲得的14株煙草抗性幼苗移栽后培養(yǎng)一個月，取幼嫩葉片進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色結(jié)果顯示:14株煙草抗性植株中有9株GUS組織化學(xué)染色結(jié)果呈陽性(圖10a)，GUS染色結(jié)果呈陽性的煙草提取基因組DNA進(jìn)行PCR驗證，設(shè)非轉(zhuǎn)基因煙草為野生型(WT)，設(shè)轉(zhuǎn)pSH737初始載體的煙草為空白對照組(CK)，結(jié)果顯示，有8株遺傳轉(zhuǎn)化的煙草擴(kuò)增出了1 500 bp左右的特異性條帶(圖10b)，確定為轉(zhuǎn)EuCGT1基因煙草。

圖10 轉(zhuǎn)基因煙草鑒定Fig.10 Detection of transgenic tobacco

幼苗移栽花盆培養(yǎng)一個月之后，經(jīng)鑒定確定為EuCGT1轉(zhuǎn)基因煙草植株與野生型煙草植株在表型上無明顯差異(圖11)。

圖11 轉(zhuǎn)EuCGT1煙草與野生型煙草表性對比Fig.11 Phenotype comparison among the transgenic lines and the wild type

3 討論

木脂素(Lignan)是一類由兩分子苯丙素衍生物聚合而成的天然化合物，構(gòu)成木脂素的單體有桂皮酸、桂皮醇、丙烯苯、烯丙苯等。木脂素類單體物質(zhì)是通過桂皮酸合成途徑合成，再由單體聚合形成木脂素。木脂素是植物植保素的一大類，能增加植物的拒食性，幫助植物抵御蟲害［10］。

松脂醇雙糖苷是杜仲中最具代表性的木脂素糖苷類化合物，目前的研究顯示松脂醇雙糖苷僅在杜仲被發(fā)現(xiàn)。該化合物具有雙向血壓調(diào)節(jié)作用，是目前公認(rèn)的最為安全的天然降壓藥物［11］，這與其兩端的芳環(huán)羥基糖苷化結(jié)構(gòu)密不可分［4］。松柏醇雙糖苷的母核是由兩個松柏醇通過支鏈烯醇聚合形成的具有手性結(jié)構(gòu)的雙環(huán)氧木脂素。松柏醇是苯丙素類生物合成途徑在植物細(xì)胞質(zhì)中合成的終產(chǎn)物之一，與對-羥基香豆醇、芥子醇一起統(tǒng)稱為單體木質(zhì)醇(monolignols)，單體木質(zhì)醇更主要參與植物木質(zhì)化矩陣構(gòu)建合成木質(zhì)素(Lignins)［12］［13］，是組成植物次生細(xì)胞壁的主要成分［6］。

木質(zhì)素的調(diào)控按其功能可分為三類:(1)苯丙酸途徑的調(diào)控，有PAL、C4H和4CL。該類酶是直接控制木質(zhì)素合成途徑流量的開關(guān);(2)木質(zhì)素單體特異合成相關(guān)酶，主要有COMT、CCoAOMT和FSH。該類酶承接上游反應(yīng)，將代謝途徑分配到三中不同木質(zhì)素之路，調(diào)控該類酶能控制三種木質(zhì)素單體的煮成比例;(3)木質(zhì)素單體特異合成途徑下游酶類，包括CAD［14］和CCR，該類酶直接催化流入分支的化合物直接合成木質(zhì)素單體。

細(xì)胞質(zhì)中合成的單體木質(zhì)醇包括松柏醇在內(nèi)都對植物細(xì)胞本身都具有細(xì)胞毒性且結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定［15］，其芳環(huán)的對位羥基氫活躍，易發(fā)生隨機聚合。研究發(fā)現(xiàn)該位置羥基經(jīng)糖基化修飾后能降低其細(xì)胞毒性，是木質(zhì)素前體的主要儲存形式［16］。

Minako等人［17］以［3H］Phe為前體進(jìn)行放射性標(biāo)記研究，發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素類衍生物雖然與高爾基體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)，而更多的則出現(xiàn)在液泡中。大部分單體木質(zhì)醇會在胞質(zhì)UDP-糖基化轉(zhuǎn)移酶的作用下催化合成單體木質(zhì)醇苷，通過ABC轉(zhuǎn)運載體運載至液泡中儲存［7，18］。松柏醇糖基轉(zhuǎn)移酶催化松柏醇糖基化反應(yīng)合成松柏苷，目前的研究僅在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)有糖基化轉(zhuǎn)移酶能催化木質(zhì)醇的糖苷化反應(yīng)，普遍認(rèn)為細(xì)胞壁中不存在糖基化轉(zhuǎn)移酶，推測木脂素糖苷類化合物糖苷結(jié)構(gòu)的引入可能也是由細(xì)胞質(zhì)中的單體木質(zhì)醇糖苷轉(zhuǎn)移酶催化合成的?？寺《胖俚乃砂卮继腔D(zhuǎn)移酶基因(EuCGT1)能為揭示杜仲特有的松脂醇雙糖苷的合成調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。

本研究克隆的EuCGT1序列經(jīng)blastn、blastp比對，結(jié)果均支持該基因及其推測編碼的氨基酸序列確實屬于UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(UDP-GT)，且序列完整包含轉(zhuǎn)錄組中的CGT片段，將該基因命名為杜仲松柏醇糖基轉(zhuǎn)移酶基因。三級結(jié)構(gòu)建模進(jìn)一步證明了EuCGT1骨架符合糖基轉(zhuǎn)移酶的特征。

EuCGT1與CD03784三級結(jié)構(gòu)模型在糖基供體結(jié)合位點上有1個保守氨基酸差異，推測該氨基酸可能與堿基識別有關(guān)，提示EuCGT1結(jié)合的葡萄糖類型應(yīng)該是UDP-葡萄糖，而非CD03784所識別的TDP-葡萄糖，這一點也在Multi-domains UDPGT的比對中得到驗證(idents＞81%);同時值得注意的是，CD03784下屬的超家族糖基轉(zhuǎn)移酶(多來源于細(xì)菌)幾乎都能形成催化中心相背的二聚體，主要由6個氨基酸在空間上形成位置鄰近的二聚體保守結(jié)構(gòu)域，而EuCGT1完全不具備該保守結(jié)構(gòu)域，推測EuCGT1不會形成二聚體，使之區(qū)別于細(xì)菌的糖基轉(zhuǎn)移酶，但EuCGT1三級結(jié)構(gòu)建模會與細(xì)菌的糖基轉(zhuǎn)移酶具備同源性，推測可能與杜仲在進(jìn)化上的獨特地位有關(guān)。

新基因功能研究的常規(guī)策略主要有:生物信息學(xué)分析、基因的mRNA和蛋白水平表達(dá)分析、基因功能獲得研究、基因功能丟失研究、以及編碼蛋白互作研究［19］，其中轉(zhuǎn)基因技術(shù)作為基因功能獲得研究中最常用的技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于新基因功能研究。本研究將克隆獲得的EuCGT1基因構(gòu)建了pSH-35S-EuCGT1植物表達(dá)載體并使用農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化煙草，經(jīng)驗證為轉(zhuǎn)EuCGT1基因的煙株在表型上與野生型煙株無明顯差異，推測是因為Eu-CGT1基因作為次生代謝途徑的產(chǎn)物修飾基因，無法直接影響次生代謝通路的流量。后續(xù)可通過測定該基因催化反應(yīng)底物與產(chǎn)物含量變化驗證基因的功能。

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