康美玲+周振華+田忠景+明東風(fēng)+馬麗

摘要：根據(jù)在NCBI中已登錄的植物轉(zhuǎn)錄因子NAC家族中與抗逆性有關(guān)成員的核苷酸序列和氨基酸序列，應(yīng)用生物信息學(xué)軟件分析了其理化性質(zhì)、疏水性/親水性、跨膜結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、功能結(jié)構(gòu)域等，并構(gòu)建了這類NAC家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果表明，17種NAC成員的蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)中存在明顯的疏水區(qū)和親水區(qū)，都存在明顯的ɑ-螺旋和β折疊。二級(jí)結(jié)構(gòu)組成上相似，都由ɑ-螺旋、β折疊和無(wú)規(guī)則卷曲組成。這些成員都能夠通過(guò)同源建模分析NAC蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。進(jìn)化分析表明，它們主要分成4大類群。通過(guò)多序列比對(duì)得到了這些成員的保守區(qū)段，并設(shè)計(jì)了簡(jiǎn)并引物。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)錄因子；NAC；生物信息學(xué)分析；抗逆性

中圖分類號(hào)：R318.04 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）17-4199-06

Bioinformatics of the Transcription Factor NAC with Stress Resistance

KANG Mei-ling， ZHOU Zhen-hua， TIAN Zhong-jing， MING Dong-feng， MA Li

（College of Life Science， Zaozhuang University， Zaozhuang 277160，Shandong，China）

Abstract：Physicochemical property， hydrophobic/hydrophilic，membrane structure，secondary structure，functional domains of resistance-realated members in the family of plant transcription factor NAC were analyzed with bioinformatics. The results showed that primary structure of 17 NAC members had obvious hydrophobic and hydrophilic areas， ɑ-helix and β-sheet were discovered in their primary structure prediction. Their secondary structure was composed of ɑ-helix， β-sheet and irregular curl. Three-dimensional structure of the NAC proteins was established by homology modeling. Phylogenetic analysis showed that they were divided into four groups. By the alignment of multiple sequence，conservative sections of these members were obtained and a pair of primer was designed. The work will pave the way for further studing the expression regulation of the NAC transcription factors related with resistance.

Key words：transcription factor；NAC；bioinformatics analysis；resistance

生物體內(nèi)有大量的轉(zhuǎn)錄因子存在，它實(shí)際上是一種反式作用因子，存在于眾多不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，可以特異地與順式作用元件結(jié)合，從而調(diào)控目標(biāo)基因的表達(dá)，是各種生化生理活動(dòng)調(diào)節(jié)的關(guān)鍵所在[1]。根據(jù)DAN結(jié)構(gòu)域的不同可以把轉(zhuǎn)錄因子分為很多家族，其中NAC家族就是一種具有多種生物功能的植物特異轉(zhuǎn)錄因子。1996年，Souer等[2]在矮牽牛中獲得了第一個(gè)NAC基因。之后，研究者在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了CUC2[3]。CUC2和NAM同屬于NAM亞族，水稻的ONAC300、金魚草的CUP和南瓜的CmNACP也屬于這個(gè)亞族[4]。Vroemen等[5]從擬南芥中分離到與CUC1和CUC2同源的CUC3。CUC促進(jìn)莖尖分生組織的分化，參與器官邊界的形成。隨后，AtNAM的發(fā)現(xiàn)及其相關(guān)功能的研究表明，分生組織的形成和器官邊界的建立與AtNAM密不可分[6]。2003年，Ooka等[7]首次將NAC家族分為2個(gè)大組和18個(gè)亞組。之后對(duì)NAC亞家族成員的研究基本上都是以O(shè)oka的分類為依據(jù)展開的。作為具有重要功能的轉(zhuǎn)錄因子，利用生物信息學(xué)的方法對(duì)其進(jìn)行全面分析，有助于獲取關(guān)于NAC家族更多的信息，從而為其功能基因組學(xué)的研究提供更為詳盡的數(shù)據(jù)。

1 轉(zhuǎn)錄因子NAC的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與生物學(xué)功能

NAC轉(zhuǎn)錄因子有著鮮明的特點(diǎn)，在其蛋白質(zhì)的N端有高度保守的約150個(gè)氨基酸組成的NAC結(jié)構(gòu)域。NAC結(jié)構(gòu)域不包含任何已知的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，而是由幾個(gè)不規(guī)則的卷曲螺旋圍繞著一個(gè)扭曲的β-折疊片構(gòu)成，與典型的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)有較大差別[8]。典型的NAC蛋白質(zhì)的N端有一段高度保守區(qū)，該區(qū)可進(jìn)一步分成A～E五個(gè)亞結(jié)構(gòu)域，可結(jié)合蛋白質(zhì)或DNA，也可參與二聚化過(guò)程。碳端是高變區(qū)，對(duì)轉(zhuǎn)錄過(guò)程起調(diào)控作用[9]。

NAC轉(zhuǎn)錄因子是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，廣泛分布于苔鮮植物到高等雙子葉植物中。研究表明，NAC轉(zhuǎn)錄因子具有諸多生物功能，詳見表1。

2 數(shù)據(jù)與方法

從NCBI網(wǎng)站的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選了17種NAC家族中與抗逆性有關(guān)的核苷酸序列及其對(duì)應(yīng)的氨基酸序列，以此作為試驗(yàn)分析數(shù)據(jù)（表2）。endprint

分析方法：NAC編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)采用Protparam預(yù)測(cè)；疏水性/親水性采用ProtScale進(jìn)行預(yù)測(cè)；跨膜結(jié)構(gòu)域采用TMPred預(yù)測(cè)；卷曲螺旋采用COILS預(yù)測(cè)；蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)采用GOR4預(yù)測(cè)；蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位采用WOLF PSORT預(yù)測(cè)；蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)分析與同源建模采用CPHmodels和RasMol-Raindy進(jìn)行；進(jìn)化樹的構(gòu)建采用軟件ClustalW2和MEGA 4.1進(jìn)行分析，各分析軟件的網(wǎng)址見表3。

3 結(jié)果與分析

3.1 蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)分析

3.1.1 氨基酸序列的理化性質(zhì)分析 利用在線分析軟件Protparam對(duì)17種NAC家族成員逐一進(jìn)行分析，得出對(duì)應(yīng)氨基酸序列的理化性質(zhì)分析結(jié)果。結(jié)果（表4）表明，這些成員的氨基酸殘基數(shù)為293～464，分子量為33 164.7～51 493.5，差異比較小，PI值多在6～8范圍內(nèi)。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，含量最豐富的氨基酸有Ser、Gly、Pro、Ala等。這些氨基酸使蛋白質(zhì)序列有較多的負(fù)電荷。通常不穩(wěn)定系數(shù)小于40，則認(rèn)為該蛋白質(zhì)是穩(wěn)定的，反之則不穩(wěn)定。供試的17種NAC成員有8種是不穩(wěn)定的，推測(cè)這8種成員在植物體內(nèi)可能是階段性出現(xiàn)，如在受到脅迫誘導(dǎo)時(shí)才會(huì)表達(dá)的一些蛋白質(zhì)，會(huì)表現(xiàn)出一定的不穩(wěn)定性，而長(zhǎng)期存在于植物體內(nèi)的NAC成員則相對(duì)穩(wěn)定。另外，這17種成員的平均疏水性皆為負(fù)值，都在-0.6左右，說(shuō)明這些蛋白質(zhì)是親水性蛋白質(zhì)。

3.1.2 疏水性/親水性的預(yù)測(cè)和分析 蛋白質(zhì)親疏水性氨基酸的組成是蛋白質(zhì)折疊的主要驅(qū)動(dòng)力，通過(guò)親水性預(yù)測(cè)可以反映蛋白質(zhì)的折疊情況。蛋白質(zhì)疏水區(qū)域可以作為評(píng)判潛在跨膜區(qū)的參考依據(jù)。采用ProtScale對(duì)17種NAC家族成員蛋白質(zhì)序列進(jìn)行分析（圖1），發(fā)現(xiàn)這17種成員在40～50區(qū)、110～130區(qū)有較強(qiáng)的疏水性，表明這些區(qū)段很可能以ɑ-螺旋的形式存在，在60～80區(qū)域有著強(qiáng)烈的親水性，表明該區(qū)段是由一些非ɑ-螺旋的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成。

3.1.3 跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)和分析 跨膜結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)和膜內(nèi)在蛋白質(zhì)通過(guò)靜電作用和氫鍵鍵合作用與膜結(jié)合而形成的一段氨基酸片段，一般由20個(gè)左右的疏水性氨基酸殘基組成，主要形成ɑ-螺旋。用在線工具TMPred對(duì)這17種NAC成員進(jìn)行分析，結(jié)果（圖2）表明，沒有強(qiáng)烈的推薦模型，推測(cè)NAC是通過(guò)核孔復(fù)合體進(jìn)入細(xì)胞核的，并不像膜結(jié)合蛋白質(zhì)那樣，通過(guò)一些跨膜結(jié)構(gòu)域固定在細(xì)胞膜上或細(xì)胞器膜上。

3.1.4 卷曲螺旋預(yù)測(cè) 利用在線分析工具COILS對(duì)17種NAC成員進(jìn)行分析，結(jié)果（圖3）表明，這些成員都沒有太多的卷曲螺旋，只在150～200氨基酸殘基位置出現(xiàn)少量的卷曲螺旋，在這些轉(zhuǎn)錄因子的N段、C段都有極少量的卷曲存在。卷曲螺旋是一種無(wú)規(guī)則結(jié)構(gòu)，在蛋白質(zhì)中起固定作用，即穩(wěn)定已形成的轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物。150～200區(qū)段雖然不在保守區(qū)范圍內(nèi)，但在長(zhǎng)久的進(jìn)化過(guò)程中，這種結(jié)構(gòu)卻相當(dāng)保守，這段無(wú)規(guī)則卷曲的存在對(duì)于NAC發(fā)揮其作用是必需的。

3.1.5 亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè) 利用在線工具WOLF PSORT分別對(duì)17種NAC成員蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位進(jìn)行分析，結(jié)果表明，它們都定位于細(xì)胞核，這也從側(cè)面表明了這些轉(zhuǎn)錄因子的存在及其發(fā)揮功能的場(chǎng)所是細(xì)胞核。

3.2 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)和分析

二級(jí)結(jié)構(gòu)指蛋白質(zhì)多肽鏈本身的折疊和盤繞的方式。二級(jí)結(jié)構(gòu)主要有ɑ-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲。采用GOR4分析17種NAC家族成員的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，這17種NAC家族成員在二級(jí)結(jié)構(gòu)上也具有很高的相似性。如圖4所示，列出的這3種成員的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示在0～50、150～250氨基酸殘基的位置上，一般出現(xiàn)ɑ-螺旋，100～150氨基酸殘基的位置上則出現(xiàn)較多的β-折疊，其他位置則被無(wú)規(guī)則卷曲填充。總體來(lái)看，17種成員的二級(jí)結(jié)構(gòu)有著較高的相似性，這從某種程度上反映了它們?cè)谌?jí)結(jié)構(gòu)上的相似性。

3.3 蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)分析與同源建模

蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)和分析，對(duì)理解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系有一定的作用。生物信息學(xué)的快速發(fā)展，使通過(guò)生物軟件構(gòu)建蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)得以實(shí)現(xiàn)。利用CPHmodels對(duì)17種NAC家族成員進(jìn)行同源建模，并用RasMol-Raindy將結(jié)果進(jìn)行處理（圖5）。結(jié)果表明，17種成員在三級(jí)結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)出了非常高的相似性，基本上都是幾個(gè)螺旋元件包圍著一個(gè)扭曲的β-折疊片，推測(cè)它們是以這種結(jié)構(gòu)結(jié)合DNA，進(jìn)而發(fā)揮作用。另外，在這些結(jié)構(gòu)群之外都有一段較長(zhǎng)的無(wú)規(guī)則卷曲，推測(cè)這個(gè)小尾巴的功能是在轉(zhuǎn)錄因子NAC結(jié)合順式作用元件時(shí)的穩(wěn)定結(jié)合體。

3.4 NAC蛋白質(zhì)家族系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

根據(jù)蛋白質(zhì)的序列或結(jié)構(gòu)差異關(guān)系可構(gòu)建分子進(jìn)化樹或種系發(fā)生樹。采用MEGA 4.1中的Neighbor-Joining算法，自檢舉1 000次，構(gòu)建了17種成員的進(jìn)化樹（圖6），這17種成員主要分為4個(gè)類群，最早在0.4水平形成兩個(gè)分支，一支是類群Ⅳ，另一支在0.3水平形成明顯的3個(gè)新的分支，它們是類群Ⅰ、類群Ⅱ、類群Ⅲ?？偟膩?lái)說(shuō)，這些NAC家族成員在0.4水平才出現(xiàn)分支，說(shuō)明它們的親緣關(guān)系相近。

3.5 相似性比對(duì)分析及保守區(qū)的獲得

利用在線程序ClustalW2進(jìn)行序列比對(duì)，找到了NAC家族中的保守區(qū)段。如圖7所示，能明顯看出N端的5段保守區(qū)。這5段保守區(qū)對(duì)應(yīng)的二級(jí)結(jié)構(gòu)可以根據(jù)對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基順序，從二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)中找到對(duì)應(yīng)的結(jié)構(gòu)。在此基礎(chǔ)上可以設(shè)計(jì)出這類抗逆性相關(guān)的NAC成員的保守區(qū)引物（圖8）。利用該引物可進(jìn)一步克隆到NAC基因的保守區(qū)，再通過(guò)RACE技術(shù)就能進(jìn)一步獲得NAC全長(zhǎng)基因，為未鑒定過(guò)的植物獲得NAC基因奠定了基礎(chǔ)。

4 小結(jié)

近年來(lái)的研究表明，多達(dá)幾十種植物中的NAC轉(zhuǎn)錄因子被發(fā)現(xiàn)，并對(duì)其空間結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能的研究進(jìn)行了探討，但是由于種類的多樣性和生物功能的復(fù)雜性，還未能明確闡明不同的NAC轉(zhuǎn)錄因子其空間結(jié)構(gòu)與調(diào)控機(jī)制之間的關(guān)系，因此通過(guò)多種生物信息學(xué)方法，對(duì)與抗逆性相關(guān)的NAC轉(zhuǎn)錄因子成員進(jìn)行多角度的分析，為其高效利用提供參考，也為植物在抗逆性方面的遺傳改良奠定理論基礎(chǔ)。endprint

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