郝芳芳 王秀然 張?zhí)熘? 劉思陽 王巖 盧天成

摘要 [目的] 利用生物信息學方法初步探討蟲草屬日本擬青霉的分類地位。[方法] 提取日本擬青霉的基因組，并利用通用引物ITSL和ITS4采用PCR技術(shù)擴增rDNA18S28S ITS序列。采用Clustalx1.83和MEGA5軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，生物信息學比較分析確定其分類地位。[結(jié)果]PCR擴增產(chǎn)物為603 bp。將日本擬青霉重新命名為雪花高雄山蟲草（Cordyceps takaomontana strain JLsnow）。將蟲草重新分類，并對該類群及其特征進行了描述。[結(jié)論] 從分子水平上說明日本擬青霉與其他蟲草之間的差異，該研究為蟲草屬真菌的分類提供新思路。

關(guān)鍵詞 冬蟲夏草；ITS；進化樹；日本擬青霉；雪花高雄山蟲草

中圖分類號 S188 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）31-10848-03

Molecular Characterization of a Cordyceps takaomontana Strain

HAO Fangfang1， WANG Xiuran1， ZHANG Tianzhu2， LU Tiancheng et al

（1. College of Life Sciences， Jilin Agricultural University， Changchun， Jilin 130118； 2 College of Pharmacy， Changchun University of Chinese Medicine， Changchun， Jilin 130117）

Abstract [Objective] The aim was to discuss classification position of Cordyceps takaomontana using bioinformatics methods .[Method]Genome of Paecilomyces japonica were extracted and rDNA18S28S ITS sequences by PCR using universal primers ITSL and ITS4 were amplified， followed by sequencing.[Result] The PCR amplified product was 603 bp .Comparative analysis of bioinformatics using Clustalx1.83 and MEGA5 software was clone to construct a phylogenetic tree， and the molecular taxonomic status was identified according to our newdivided taxon. Paecilomyces japonica should rename as Cordyceps takaomontana strain JLsnow. Species included in this taxon and their characteristics were described. [Conclusion] The difference between Japan Cordycepstakaomontana and Chinese cordyceps fungi was devealed，and the study provided new ideas for the classification of cordyceps fungi.

Key words Cordyceps； ITS； Phylogenetic tree； Peacilomyces japonica； Cordyceps takaomontana

冬蟲夏草（Ophiocordyceps sinensis）是由子囊菌綱真菌寄生在蝙蝠蛾幼蟲尸體的子座-幼蟲復合體。冬蟲夏草具有較高的滋補保健功效，是世界上最稀有、珍貴的藥用真菌之一^[1]。冬蟲夏草的自然資源十分稀少。日本擬青霉（Peacilomyces japonica）作為食用蘑菇在韓國被廣泛應(yīng)用，這可能是新的替代蟲草的資源。然而其分類地位不明確^[2-5]。蟲草屬是一個多品種復雜的真菌群，在種屬分類水平上關(guān)系復雜。目前學者經(jīng)常使用電源系統(tǒng)研究蟲草亞屬或亞群的分類^[6]。然而，蟲草是一個品種多樣且形態(tài)復雜的物種。形態(tài)學描述沒有統(tǒng)一的標準，因此形態(tài)的描述過于主觀。另外，在多種因素的作用下有些菌株的形態(tài)和生理生化指標均不穩(wěn)定。此外，形態(tài)學的最大缺點在于它不能應(yīng)用于活菌。因此單獨使用傳統(tǒng)的分類方法可能不能解決這些問題^[7-8]。

分子生物學技術(shù)在真菌分類上介紹了更具體、準確而可靠的分子生物學技術(shù)的鑒定方法，如DNA堿基組成分析、限制性片段多態(tài)性（RFLP）、隨機擴增多態(tài)性DNA（RAPD）、脈沖電場凝膠電泳（PFGE）和小亞基rDNA或rRNA測序^[9]。這些方法彌補了傳統(tǒng)分類的不足，為真菌分類學的研究開辟了途徑。真菌的核糖體DNA（rDNA）是指rRNA基因簇的重復單元，包括5.8S，18S和28S rRNA基因及其相鄰的非轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（NTS）和非轉(zhuǎn)錄區(qū)（NTR），有些生物物種中還包括5S rRNA。rDNA基因序列在進化過程中保守強、拷貝數(shù)多，且包含可變區(qū)和高變區(qū)。因此，rDNA基因序列分析是真菌分類學家關(guān)注的焦點。對于大多數(shù)真核生物而言，rDNA包括非轉(zhuǎn)錄區(qū)（NTS）、18S rDNA的外部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ETS）、5.8S rDNA的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1（ITS1）、28S rDNA的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2（ITS2），總長度為7.7～24 kb^[10]。

18SrDNA 的序列信息還不足以對真菌種間進行精確鑒別，必須借助其他序列信息作補充，ITS序列信息起到了很好的作用。ITS1和ITS2是中度保守的區(qū)域，且種內(nèi)保守性相對一致，但種間差異明顯。這些特性使ITS適用于真菌物種的分子鑒定，以及屬內(nèi)物種間或種內(nèi)差異明顯的親緣關(guān)系的分析。rDNA的 IGS區(qū)（NTS，ETS）速度進化最快，與ITS區(qū)域相比，IGS區(qū)域因為變異太高不適宜某些真菌的種間鑒別^[11]。總體而言，真菌rDNA的基因間隔區(qū)（NTS，ETS，ITS）為高度重復序列，且該序列的重復數(shù)在菌株之間的差異明顯。采用適當?shù)囊锘蛱结樌肞CR或Southern雜交顯示菌株多態(tài)性可作為研究真菌類群屬種水平的分類學指標。該rDNA編碼的基因序列（5.8S，18S和28S rDNA序列）具有較強的保守性，所以最能反映真菌間的親緣關(guān)系。

筆者擴增日本擬青霉的rDNA基因并分析了18S rDNA和ITS序列，利用生物信息學方法初步探討蟲草屬日本擬青霉的分類地位，通過對日本擬青霉進行分子鑒定，從分子水平上說明日本擬青霉與其他蟲草之間的差異，以期為蟲草屬真菌的分類提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 由東北師范大學生命科學學院太龍杰教授提供日本擬青霉菌株并存儲在實驗室中。固體培養(yǎng)基：馬鈴薯提取物20 g，蔗糖2 g，瓊脂2 g，蒸餾水100 ml。液體培養(yǎng)基：馬鈴薯提取物20 g，蔗糖2 g，蒸餾水100 ml。市場上購買的桑蠶蛹。天恩澤基因組提取試劑盒用于基因組提取。

1.2 日本擬青霉的栽培 將該菌株切成塊，分別接種于固體平板上27 ℃培養(yǎng)6 d。將活化好的菌種取1 cm2小塊接種至含有100 ml液體培養(yǎng)基的三角瓶中，25 ℃、140 r/min培養(yǎng)48 h。對日本擬青霉進行固體培養(yǎng)：將10 ml培養(yǎng)液接種至含有100 g蠶蛹的無菌瓶中，27 ℃培養(yǎng)7 d，然后在20～25 ℃下培養(yǎng)，濕度90%，弱光培養(yǎng)25～30 d。子實體和基質(zhì)形態(tài)記錄：子實體的長度、直徑、重量。

1.3 PCR擴增和測序 菌絲體離心后將沉淀轉(zhuǎn)移至一個塑料研缽中，液氮研磨成粉末，然后轉(zhuǎn)移到1.5 ml Eppendorf管中。使用天恩澤基因組提取試劑盒提取基因組DNA。通用引物如下：fwd_itsl：5′tcg taa caa ggt ttc cgt agg tg3′，rev_its4：5′tcc tcc gct tat tga tat gc3′。PCR條件：94 ℃ 5 min；94 ℃30 s，56 ℃30 s，72 ℃1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行分離（電壓120 V，時間15～20 min）。將該序列用Axigen 凝膠回收試劑盒（Axygen Co.，China）進行回收并送出測序（北京華大公司）。

1.4 系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

在NCBI GenBank上提交該序列，編號為JQ009304.1。在NCBI上進行比對相似度最高的序列確定為分離真菌的分類地位。使用clustalx1.83軟件進行序列比對，MEGA5用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學分析 日本擬青霉菌株以蠶蛹作為培養(yǎng)基加濕培養(yǎng)30 d。日本擬青霉的外觀形態(tài)見圖1。子座濕度低，孢子化程度較低僅頂部有孢子覆蓋，子實體平均株高4.4 cm，子實體平均濕重0.161 g/10根，平均干重0.049 g/10根，干

濕比0.305。相比之下，人工栽培蛹蟲草子實體的平均株高

為2.0～6.3 cm；子實體的平均濕重最低0.002 g/10根，最高

2.3 系統(tǒng)進化樹 分析了日本擬青霉菌株的5.8SrDNA和ITS序列，并結(jié)合NCBI GenBank中已有的日本擬青霉的5.8SrDNA和ITS序列，構(gòu)建了蟲草屬的系統(tǒng)發(fā)育樹，并確定了日本擬青霉菌株的分類地位。日本擬青霉的5.8SrDNA和ITS序列與其他蟲草菌株比對結(jié)果（圖4）顯示，日本擬青霉與高雄山蟲草聚類成一支，相似度為99.4%，bootstrap可信度分析達45%。這個蟲草菌株與蟲草屬的其他3個品種即雙縮孢蟲草

（Cordyceps bifusispora）、高雄山蟲草（塔薩蟲草）（Cordyceps cf.takaomontana）和珊瑚蟲草（Cordyceps martialis）先后聚類。其中日本擬青霉與高雄山蟲草（塔薩蟲草）bootstrap可信度分析達45%，相似度為99.9%；日本擬青霉的ITS序列與高雄山蟲草

（Cordyceps takaomontana（AB189443））的相關(guān)序列親緣關(guān)系非常接近，其序列之間的相似度達100.0%。而日本擬青霉、高雄山蟲草和珊瑚蟲草聚類成一支，bootstrap可信度分析達61%，相似度為89.9%。日本擬青霉的ITS序列與珊瑚蟲草的相關(guān)序列的相似度高達95.8%。與雙縮孢蟲草和珊瑚蟲草相比，日本擬青霉與高雄山蟲草的相似性最高，這顯示日本擬青霉和高雄山蟲草為蟲草屬中同一物種。因此，將日本擬青霉重新命名為雪花高雄山蟲草（Cordyceps takaomontana strain JLsnow）。

3 討論

NJ樹通過鄰接法（NJ）利用試驗序列和Genbank 序列所構(gòu)建的系統(tǒng)聚類樹可以看出，同屬聚類在一起，且各物種又形成相對獨立的枝，其支持率基本上可信?；贑OI序列的NJ樹能夠明顯地看出蟲草不同的種屬能夠很好地區(qū)分開。日本擬青霉所在群包括16個種，分別是Cordyceps ninchukispora strain，Cordyceps militaris^[13]，Cordyceps roseostromata strain ARS，Cordyceps kyushuensis voucher Y.L.Guo HMAS 78115^[14]，Cordyceps confragosa，Cordyceps scarabaeicola^[15]，Cordyceps scarabaeucika，Cordyceps cf.militaris，Cordyceps bassiana^[16]，Cordyceps brongniartii^[17]，Cordyceps tuberculata strain BCC16819^[18]，Cordyceps spegazzinii^[19]，Cordyceps bifusispora^[20]，Cordyceps cf.takaomontana BCC28612，Cordyceps martialis^[21]，雪花高雄山蟲草（Cordyceps takaomontana strain Jlsnow）^[22]，高雄山蟲草（塔薩蟲草）（Cordyceps takaomontana）^[22]。這16個種聚類成大小不等的2支，較小的1支包含4個種類，bootstrap可信度分析最低為46%，最高可達95%，相似度大于78.6%。較大的一支包含12個種類，bootstrap可信度分析最低為32%，最高可達83%，相似度大于85.6%。雪花高雄山蟲草與高雄山蟲草（塔薩蟲草）被歸為同一個物種。

該群的特征包括：①寄主是鱗翅目昆蟲蛹、鱗翅目幼蟲，雪花冬蟲夏草的寄主為鱗翅目蛹。②基質(zhì)單生或群生，橙黃色或紅色的 根狀菌索固著在寄主上，由寄主的頭部和其他部分出芽，為圓柱狀或棒狀，通常有一個尖端，高1～9 cm，頭部和柄可分枝，橙紅色，柄多彎曲；頭部棒狀，孢子線性有許多隔膜。雪花高雄山蟲草的形態(tài)學特征為基質(zhì)群生，子實體為淡黃色固著于寄主上，呈圓柱狀，具有尖銳的頂端，高4～5 cm；頭部呈棒狀，有分枝。兩者的形態(tài)特征非常相似。③寄主蛹大多布滿白色菌絲。雪花高雄山蟲草寄主蛹外也布滿雪白色的菌絲（因此而得名）。④它們分布在潮濕的地區(qū)，如中國浙江、安徽、河南、福建、廣東、臺灣以及日本。雪花高雄山蟲草分布在中國臺灣和日本等氣候潮濕的地區(qū)。分布情況也表明該研究的雪花高雄山蟲草與所在蟲草屬群具有很高的親緣性。

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