陳逸云， 王 楓， 徐志勝， 譚國飛， 李夢瑤， 熊愛生

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部華東地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，園藝學(xué)院，江蘇南京210095)

芹菜(Apium graveolens)為傘形科(Umbelliferae)芹屬中一、二年生草本植物，原產(chǎn)于地中海沿岸的沼澤地帶，世界各國已普遍栽培。芹菜富含蛋白質(zhì)、碳水化合物、胡蘿卜素、B族維生素等，具有食用、藥用價(jià)值，是中國重要的蔬菜之一。

黃酮類化合物是一種小分子酚類物質(zhì)，廣泛存在于植物界，具有多種生物功能，是一類生物活性很強(qiáng)的化合物，在植物抗病蟲中起重要的作用［1-4］。黃酮類化合物還是一種天然的抗氧化劑，在抗癌、防癌等方面也有顯著效果［5］。植物中主要存在2種黃酮合成酶，即黃酮合成酶I(FSⅠ)和黃酮合成酶Ⅱ(FSⅡ)。FSⅠ是可溶性的，它是2-氧代戊二酸依賴的酶［6］;FSⅡ?qū)儆诩?xì)胞色素P450單氧化酶，催化反應(yīng)依賴于 NADPH［7-8］。目前為 止，已 在 茶 樹［9］、大 豆［10］、馬 鈴 薯［11］、苜蓿［12］、高粱［13］、水稻［14］等植物中分離出多種黃酮類化合物合成酶的相關(guān)基因。

本試驗(yàn)分別從3個(gè)芹菜材料六合黃心芹、津南實(shí)芹和美國西芹中克隆芹菜黃酮合成酶 I基因Ag-FS I，對其序列進(jìn)行分析，為深入研究芹菜黃酮合成酶的功能提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料、菌株、質(zhì)粒

本試驗(yàn)選用的芹菜材料六合黃心芹、津南實(shí)芹和美國西芹均保存在本實(shí)驗(yàn)室，種植于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江浦基地和南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室人工氣候室。取用部位為芹菜的嫩葉部。

大腸桿菌菌株DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存;質(zhì)粒載體 pMD18-T vector、分子量 Marker、Ex-Taq聚合酶和各類限制性內(nèi)切酶均為大連TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 芹菜DNA的提取 芹菜DNA的提取采用CTAB 法［15］。

1.2.2 芹菜AgFS I基因的克隆 根據(jù)GenBank中旱芹的FS I基因(登錄號:AY817676)設(shè)計(jì)1對引物(NXR45:5'-ATGGCTCCATCAACTATAACTG-3';NXR46:3'-TCATATCTTCATCTTGGCCTTCTC-5')。分別以六合黃心芹、津南實(shí)芹和美國西芹的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為:94℃ 5 min;94℃30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共30個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳，用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5α

提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR鑒定后委托南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行測序。

1.2.3 芹菜AgFS I基因序列分析 芹菜AgFS I基因序列全長拼接及氨基酸翻譯采用bioXM 2.6軟件［16］;氨基酸比對及多重比較、氨基酸疏水/親水性鑒定等采用DNAMAN軟件。用NJ法構(gòu)建分子系統(tǒng)進(jìn)化樹，用MEGA 5生成報(bào)告圖形［17］。利用NCBI網(wǎng)站BLAST程序進(jìn)行同源性計(jì)算，用網(wǎng)站(http://www.expasy.org)相關(guān)軟件進(jìn)行氨基酸成分、蛋白質(zhì)分子量、等電點(diǎn)等分析［18］。蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)模型通過Swiss-Model(http://swiss-model.expasy.org)建立［19］。

2 結(jié)果與分析

2.1 芹菜AgFS I基因的克隆

分別以六合黃心芹、津南實(shí)芹和美國西芹的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到1 600 bp左右的片段(圖1)。序列測定與分析結(jié)果表明，3個(gè)芹菜來源的AgFS I基因全長為1 616 bp，其中365～723位置和1 152～1 341位置是內(nèi)含子區(qū)域。AgFS I含有1 068 bp的開放閱讀框(Open reading frame，ORF)，編碼355個(gè)氨基酸(圖2)。三者核苷酸水平上有5個(gè)堿基的差異，分別為28位(T/C/T，六合黃心芹/津南實(shí)芹/美國西芹，下同)、285 位(T/T/C)、431 位(A/A/G)、511位(A/A/G)、631 位(A/T/T)和1 001位(T/T/C)(圖3);編碼的氨基酸有5個(gè)位點(diǎn)的差異，分別為10位(S/P/S)、144位(Y/Y/C)、171位(K/K/E)、211位(M/L/L)和位(V/V/A)(圖4)。

圖1 芹菜AgFS I基因DNA片段電泳檢測Fig.1 Agarose gel electrophoresis of DNA fragment of AgFS I gene from A.graveolens

圖2 六合黃心芹AgFS I基因序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.2 Nucleotide and deduced amino acid sequences of AgFS I gene from celery Liuhehuangxinqin

2.2 芹菜AgFS I氨基酸多重序列比對與分析

對芹菜AgFS I基因推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行BLASTp同源性檢索，結(jié)果顯示:芹菜AgFS I具有20G-FeII_Oxy保守結(jié)構(gòu)域，屬于20G-FeII_Oxy超級家族(圖5)。芹菜 AgFS I與胡蘿卜(Daucus carotaAAX21536.1)、孜 然 芹 (CuminumcyminumABG78790.1)、蘋果(Malus domesticaAAX89398.1)、沙梨(Pyrus pyrifoliaADP09378.1)、桃(Prunus persicaAEJ88219.1)、茶(Camellia sinensisAAT68774.1)、金花茶(Camellia nitidissimaADZ28514.1)、牡丹(Paeonia suffruticosaAEN71544.1)、芍藥(Paeonia lactifloraAFI71897.1)物種中的FS I具有較高的相似性，相似度達(dá)84.45%(圖6)。

2.3 芹菜AgFS I蛋白質(zhì)氨基酸組成成分、理化性質(zhì)分析及親水、疏水性質(zhì)比較

圖3 3種芹菜AgFS I基因序列比對Fig.3 Alignment of gene sequences of AgFS I gene from three cultivars of A.graveolens

選取上述植物，同時(shí)增加擬南芥(Arabidopsis thalianaBAD89980.1)、油 菜 (BrassicanapusABF60660.1)、大豆(Glycine sojaACA81445.1)、苜蓿(Medicago truncatulaXP_003629323.1)，共16種不同來源植物，對其FS I蛋白質(zhì)進(jìn)行氨基酸組成成分及理化性質(zhì)分析(表1)。這些植物中的FS I蛋白質(zhì)殘基數(shù)均在355至368之間，分子量在4.0×104左右，理論等電點(diǎn)在5至6之間，堿性氨基酸與酸性氨基酸的數(shù)量基本持平。脂肪族氨基酸比例較高，芳香族只占7%～8%，蛋白質(zhì)可溶性預(yù)測中不溶蛋白質(zhì)的比例較高，在49%至65%之間。

另外，對芹菜AgFS I氨基酸序列進(jìn)行親水性和疏水性分析，結(jié)果表明，該合成酶的親水性在氨基酸第23位最強(qiáng)，第42位堿基疏水性最強(qiáng)。整體而言，AgFS I屬于疏水性蛋白(圖7)。

2.4 芹菜AgFS I氨基酸序列的進(jìn)化樹分析

根據(jù)檢索結(jié)果，選取上述植物進(jìn)行同源性進(jìn)化比對，構(gòu)建同源進(jìn)化樹(圖8)。結(jié)果表明，六合黃心芹、津南實(shí)芹、美國西芹與同屬于傘形科的胡蘿卜、孜然芹進(jìn)化關(guān)系最近。薔薇科的蘋果、沙梨、桃和山茶科的茶、金茶花在進(jìn)化關(guān)系上也較近，接著是芍藥科的牡丹、芍藥，較遠(yuǎn)的是十字花科的擬南芥、油菜和及豆科的大豆、苜蓿。進(jìn)化關(guān)系分析結(jié)果顯示，傘形科與薔薇科和山茶科的FSI進(jìn)化較近。

圖4 3種芹菜AgFS I氨基酸比對Fig.4 Alignment of amino acid sequences of AgFS I from three cultivars of Apium graveolens

圖5 六合黃心芹AgFS I保守域預(yù)測Fig.5 Prediction of the conserved domain of AgFS I from celery Liuhehuangxinqin

圖6 芹菜AgFS I氨基酸序列的多重比對Fig.6 Alignment of amino acid sequences of AgFS I from celery and other different plants

表1 不同植物來源的FS I氨基酸組成成分及理化性質(zhì)分析Table 1 Com position and physico-chemical characterization of amino acid sequences of FS I derived from various

2.5 芹菜AgFS I三級結(jié)構(gòu)預(yù)測與分析

六合黃心芹、津南實(shí)芹和美國西芹中的AgFS I與擬南芥花色素合成酶的氨基酸一致性大于60%。以擬南芥花色素合成酶空間結(jié)構(gòu)(PDB ID:1gp5)為模型，通過Swiss-Model對六合黃心芹、津南實(shí)芹和美國西芹AgFS I三維結(jié)構(gòu)建立模型(圖9)。結(jié)果顯示:六合黃心芹、津南實(shí)芹和美國西芹與擬南芥花色素合成酶PDB ID:1gp5的氨基酸同源性分別為33.3%、31.4%和33.3%，三維結(jié)構(gòu)相似，主要有3個(gè)氨基酸位點(diǎn)不同，分別是第144位(Y/Y/C，六合黃心芹/津南實(shí)芹/美國西芹，下同)、第171位(K/K/E)、第211位(M/L/L)，上述氨基酸位點(diǎn)的差異沒有導(dǎo)致芹菜AgFS I空間結(jié)構(gòu)的明顯變化。

3 討論

芹菜是是傘形科重要的蔬菜作物之一，富含蛋白質(zhì)、碳水化合物、胡蘿卜素、B族維生素、鈣、磷、鐵等，老少兼宜。本試驗(yàn)選用的3個(gè)芹菜品種中，六合黃心芹［20］和津南實(shí)芹［21］是中國地方品種，美國西芹［22］來源于美國，三者具有較大地域差別和一定的形態(tài)差異。六合黃心芹是南京市六合區(qū)的地方優(yōu)良品種，株型半直立，株高較矮，葉大、綠色、有光澤，心葉黃綠色，纖維少、清香味濃，品質(zhì)佳;津南實(shí)芹是天津市津南區(qū)選育的優(yōu)良地方品種，一般植株高大，緊湊直立，基本無分枝，葉片肥大，組織充實(shí)，風(fēng)味適口，纖維少，商品性好;美國西芹是從美國引進(jìn)經(jīng)多代提純選育而成，植株較為高大，株型緊湊，葉片寬厚脆綠、有光澤，組織充實(shí)，質(zhì)地脆嫩、纖維少，品質(zhì)佳。

圖7 芹菜AgFS I氨基酸序列親水、疏水性質(zhì)預(yù)測Fig.7 Predicted hydrophilic and hydrophobic properties of AgFS I from Apium graveolens

圖8 不同物種的FS I氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.8 Phylogenetic tree of amino acid sequences of FS I from several plant species

圖9 芹菜AgFS I的三維結(jié)構(gòu)建模Fig.9 The structural model of the AgFS I from A.graveolens

本試驗(yàn)從上述3種芹菜中克隆出的黃酮合成酶I，是植物中合成黃酮類物質(zhì)的關(guān)鍵酶之一［23］。黃酮類物質(zhì)在植物中廣泛存在，從苔蘚植物到被子植物都含有這類物質(zhì)，是一類低分子量的多酚類次生代謝產(chǎn)物［24-25］。植物中，黃酮類物質(zhì)與許多功能有關(guān)，是果實(shí)和種子顏色的主要顯色物質(zhì)，能夠保護(hù)植物抵御紫外線和防止病源微生物侵襲，調(diào)節(jié)植物生長素的運(yùn)輸，是植物和細(xì)菌相互作用中的信號分子，能促進(jìn)花粉萌發(fā)并且和花粉的育性直接相關(guān)［26］。黃酮類化合物是一類生物活性很強(qiáng)的化合物，是一種天然的抗氧化劑［5］。但前人的研究大多集中在黃酮合成酶II上，黃酮合成酶I研究相對較少。序列分析比對結(jié)果表明，3種芹菜中AgFS I基因之間核苷酸水平上有5個(gè)堿基的差異，編碼的氨基酸有5個(gè)位點(diǎn)的差異，這些不同地域來源和類型的芹菜中位點(diǎn)差異可能與芹菜某些特定的生理功能和不同地域進(jìn)化有關(guān)。與其他來源植物FSI氨基酸序列的相似性高，表明FS I具有高度保守性。同源進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，AgFS I與同屬于傘形科的胡蘿卜、孜然芹在進(jìn)化關(guān)系上屬于同一大的分枝，與薔薇科、山茶科FS I的進(jìn)化關(guān)系也較近，而與十字花科、豆科FS I在進(jìn)化上比較遠(yuǎn)，但從進(jìn)化樹上的長度來看，各科之間的進(jìn)化是相對保守的。三級結(jié)構(gòu)預(yù)測與分析發(fā)現(xiàn)，不同芹菜AgFS I雖然部分氨基酸位點(diǎn)不同，但是其空間結(jié)構(gòu)具有一定的相似性，這種空間結(jié)構(gòu)的相似性可能對于其功能非常重要。

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