張寶修， 尹 多， 姜園園， 孫婧陶， 李鐘淑， 方南洙

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)系，吉林 延吉 133000)

胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cell，ESC)是未分化的具有全能性的干細(xì)胞，能夠在體外增殖［1-3］。由于胚胎干細(xì)胞與胚胎生長特性比較接近，胚胎干細(xì)胞早期在子宮內(nèi)的代謝特點(diǎn)，因此以胚胎干細(xì)胞做為供核細(xì)胞有著很大優(yōu)勢。但胚胎干細(xì)胞只有在含氧1%～5%條件下才能生長良好。在含氧量低的條件下，胚胎干細(xì)胞自發(fā)分化會受到阻礙，并且能維持多功能性［4］，由于體外培養(yǎng)含氧量較高，所以胚胎干細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件要求較高。一些細(xì)胞在低氧條件下不能得到氧化磷酸化產(chǎn)生的ATP，必須依靠線粒體產(chǎn)生的ATP來滿足能量的需求［5］，而胚胎干細(xì)胞在含氧較低條件下仍能很好的增長并能保持細(xì)胞多功能性。但在含氧較低的子宮頸部分只有少量的不成熟的線粒體［6-7］，因此有些細(xì)胞ATP能量的供應(yīng)會受到阻礙，克隆胚胎發(fā)育受阻，胚胎干細(xì)胞做為供核細(xì)胞有利于胚胎發(fā)育，并且也能夠起到保障大量基因遺傳。試驗(yàn)結(jié)果表明，分化干細(xì)胞內(nèi)染色體數(shù)量有所增加并且形態(tài)上也更為類似［7］，胚胎干細(xì)胞可以描述胚胎分化的一個階段并可提供一個檢測早期線粒體代謝動態(tài)變化的模型。細(xì)胞通過線粒體電子運(yùn)輸系統(tǒng)產(chǎn)生大量的ATP，氧化磷酸化會產(chǎn)生氧化產(chǎn)物［8］。這些代謝產(chǎn)物可能含有活性氧，活性氧可能參與胚胎生長調(diào)節(jié)、基因表達(dá)調(diào)節(jié)等。但這些氧化產(chǎn)物過量積累，胚胎抗氧化保護(hù)機(jī)制不足，胚胎發(fā)育會受到阻礙。胚胎對氧化損傷很敏感［9］，胚胎對活性氧(Reactive oxygen species，ROS)擁有一個有效的抗氧化系統(tǒng)［10］。體外成熟或體外受精僅僅擁有自身抗氧化系統(tǒng)是不夠的，因此需要外源性抗氧化劑的加入。硒是內(nèi)源性抗氧化劑，亞硒酸鈉(Sodium selenite，SS)是清除細(xì)胞內(nèi)自由基的一種外源性抗氧化劑。觀察亞硒酸鈉在異種重構(gòu)胚胎各個時期抗氧化性，有利于體外胚胎發(fā)育率的提高，為體細(xì)胞克隆胚胎抗氧化機(jī)制研究做基礎(chǔ)。

由于誘導(dǎo)異種重構(gòu)胚獲得胚胎干細(xì)胞分化的細(xì)胞在實(shí)際應(yīng)用上的排斥反應(yīng)會大大減少等諸多原因，例如，來自異種胚胎干細(xì)胞分化的細(xì)胞用于皮膚移植排斥反應(yīng)遠(yuǎn)小于同種胚胎干細(xì)胞分化的細(xì)胞。誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化在近年來實(shí)際應(yīng)用比較廣泛。但是胚胎干細(xì)胞分化的細(xì)胞在實(shí)際應(yīng)用中危險(xiǎn)性并未真正得到證實(shí)，是否會帶來后遺癥并沒有得到驗(yàn)證。胚胎干細(xì)胞作為供核細(xì)胞抗氧化相關(guān)研究并不是很多，胚胎干細(xì)胞具有全能性，在抗氧化方面研究也就更有實(shí)際意義。

近些年來，由于稀有動物種類的不斷增加，因此在核移植科學(xué)方面上卵母細(xì)胞的供應(yīng)也越來也越少。構(gòu)思利用異種重組得到囊胚，獲得胚胎干細(xì)胞被誘導(dǎo)成能夠生育的卵母細(xì)胞的方法將會在今后人類不孕不育上做出突出貢獻(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本試驗(yàn)用小鼠為良種肉牛選育中心實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。從中選取6～8周齡的雌性小白鼠50只以及10周以上的雄性小白鼠15只。

乙二胺四乙酸(EDTA)、谷氨酰胺、乳酸鈉、葡萄糖、丙酮酸鈉、非必需氨基酸、礦物油、NaCl、KCl、KH2PO4、MgSO4、NaHCO3、CaCl2、酚紅、高糖 DMEM、絲裂霉素C、白細(xì)胞抑制因子(LIF)等均購自Sigma;胎牛血清購自四季青公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠胎兒皮膚成纖維細(xì)胞的獲得及飼養(yǎng)層的制備 取妊娠13.5 d的小白鼠，用無菌方法解剖小鼠得到胚胎，將胚胎取下之后放在含有D-PBS的無菌培養(yǎng)皿中。去除胚胎頭部、四肢和內(nèi)臟，用DPBS清洗3次或更多次。用無菌外科刀將其胚胎剪碎至1 mm3的小塊。移到無菌錐形瓶中，加入5 ml的0.25%胰蛋白酶-0.05%EDTA，在37℃的培養(yǎng)箱中消化30 min，加入10 ml的含有10%FBS的DMEM終止消化。將其過濾，濾液以1 000 r/min、7 min進(jìn)行離心。棄上清液，向離心管中加入1 ml含有20%FBS的DMEM，重懸細(xì)胞后移入無菌培養(yǎng)瓶中。在37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)成纖維細(xì)胞。

待胎兒皮膚成纖維細(xì)胞純化后，用含有10%FBS、10μg/m l絲裂霉素C的無菌DMEM處理成纖維細(xì)胞，放在37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 h。再用 PBS清洗2次，用0.25%胰蛋白酶-0.05%EDTA消化2 min，收集細(xì)胞后低速離心(1 000 r/min、7min)，去上清液，加入新鮮的含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。以密度為1 m l 2×105個接種到96孔板中，作為飼養(yǎng)層細(xì)胞待用。

1.2.2 囊胚中胚胎干細(xì)胞的分離 囊胚來自經(jīng)過超排、交配后3.5 d的小白鼠。無菌腹部取下子宮(連接輸卵管)，用室溫下的M2培養(yǎng)液沖洗子宮，將單個胚胎置于含有飼養(yǎng)層的96培養(yǎng)板孔內(nèi)，每孔加入300μl的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基(含白細(xì)胞抑制因子)，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。囊胚培養(yǎng)12 h之后，用拉成的細(xì)針從滋胚層將內(nèi)細(xì)胞團(tuán)挑出，用D-PBS清洗2次，將細(xì)胞團(tuán)移到礦物油覆蓋的0.25%胰蛋白酶-0.05%EDTA中，在37℃下孵育3～4 min后移到含血清的培養(yǎng)基中并輕輕吹散，使其成為有3～5個細(xì)胞組成的小細(xì)胞團(tuán)，不要分成單個細(xì)胞。將小滴內(nèi)的所有內(nèi)含物移到制備好的飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)。每天進(jìn)行觀察，2 d后可以見到小的克隆細(xì)胞，即胚胎干細(xì)胞。

囊胚培養(yǎng)12 h后，用PBS清洗3次，分別用濃度10μg/ml的Hoechst33342和10μg/ml碘化丙啶在37℃染色15 min(注意避光)，染色結(jié)束后用PBS清洗2次，封片，在熒光顯微鏡下觀察其染色情況并照相。

1.2.3 胚胎干細(xì)胞過氧化氫氧化損傷最適濃度的篩選 使用外源性過氧化氫(H2O2)對胚胎干細(xì)胞進(jìn)行氧化應(yīng)激刺激并建立模型，測出不同濃度的H2O2對胚胎干細(xì)胞的氧化損傷狀況，以確定建立H2O2氧化損傷模型的最適濃度。用0.25%胰蛋白酶-0.05%EDTA對細(xì)胞消化3 min，PBS清洗3次(速度要快，防止分化)，以每孔1×102～5×102個胚胎干細(xì)胞接種到96孔板，每孔細(xì)胞匯合長至80%加入200μl胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基。分別配制0 μmol/L(對 照)、30 μmol/L、60 μmol/L、90 μmol/L、120 μmol/L、150 μmol/L濃度的 H2O2，加入到胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基中。培養(yǎng)4.5 h后，每孔加入MTT溶液(5 mg/ml用PBS配)20μl繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸出孔內(nèi)上清液。每孔加150 μl DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分融解。使用酶標(biāo)儀(選擇490 nm波長)，測出OD值。處理組的OD值與對照組的OD值的比值是增殖率。以細(xì)胞增殖率50% ～60%為建立H2O2氧化損傷模型的最適濃度。

1.2.4 亞硒酸鈉對小鼠胚胎干細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用 將最適濃度的H2O2作用于細(xì)胞4.5 h后，再分別向干細(xì)胞培養(yǎng)基中加入0μmol/L(對照)、1.5 μmol/L、2.5 μmol/L、3.5 μmol/L、4.5 μmol/L和5.5μmol/L不同濃度亞硒酸鈉。用3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)法檢測細(xì)胞增殖率。

1.2.5 不同來源供核細(xì)胞的重構(gòu)胚發(fā)育率的比較 分別用小鼠胚胎干細(xì)胞和胎兒皮膚成纖維細(xì)胞作為供體細(xì)胞。超數(shù)排卵3只小白鼠后采用背部取輸卵管，去掉卵丘細(xì)胞后取出帶有第一極體的卵母細(xì)胞，放在細(xì)胞松弛素B的小滴中，采用擠壓法進(jìn)行去核。將供體細(xì)胞分別用胰蛋白酶消化后，挑選細(xì)胞質(zhì)生長均勻，質(zhì)量好的細(xì)胞做為供核細(xì)胞。將供核細(xì)胞注入到卵母細(xì)胞的卵黃周隙中，以便融合。使用直流電脈沖融合后用濃度5μmol/L的離子霉素對重構(gòu)胚進(jìn)行預(yù)激活5 min，之后移入到2 mmol/L的二甲基氨基嘌呤激活4 h。激活之后放入平衡好的培養(yǎng)液小滴中進(jìn)行培養(yǎng)，72 h進(jìn)行半量換液，每隔24 h進(jìn)行觀察記錄發(fā)育率。

1.2.6 亞硒酸鈉處理對過氧化氫氧化損傷下胚胎干細(xì)胞重構(gòu)胚發(fā)育率的影響 用最適濃度的H2O2和亞硒酸鈉處理小鼠胚胎干細(xì)胞，培養(yǎng)14 d后細(xì)胞生長匯合至80%可做為供核細(xì)胞，生產(chǎn)重構(gòu)胚，并比較其發(fā)育率。

1.2.7 奶山羊-鼠異種重構(gòu)胚的構(gòu)建 以延邊奶山羊胎兒皮膚成纖維細(xì)胞細(xì)胞做為供核細(xì)胞，來生產(chǎn)異種重構(gòu)胚，并記錄發(fā)育率。重構(gòu)胚獲取方法同方法1.2.5。

1.2.8 異種重構(gòu)胚內(nèi)部ROS含量的檢測 將胚胎從培養(yǎng)液中取出，用PBS清洗3次，置于濃度為10 μg/ml的DCFH-DA染色液小滴中，避光染色37℃15 min。PBS清洗2次。熒光顯微鏡下觀察其染色情況并照相。熒光圖片用Image-6.0軟件進(jìn)行量化分析。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 17.0軟件試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用方差分析的方法檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 胚胎干細(xì)胞的獲得

囊胚在培養(yǎng)12 h之后，分別用Hoechst 33342和PI在37℃染色可以清晰的看到內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(圖1)，獲得內(nèi)細(xì)胞團(tuán)在飼養(yǎng)層上進(jìn)行共培養(yǎng)，經(jīng)過4 d的克隆培養(yǎng)得到大量的胚胎干細(xì)胞。

2.2 亞硒酸鈉對胚胎干細(xì)胞抗氧化損傷的影響

圖1 囊胚內(nèi)的細(xì)胞團(tuán)Fig.1 Inner cellmass of blastocyst

在胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基中分別加入0μmol/L、30 μmol/L、60 μmol/L、90 μmol/L、120 μmol/L和 150 μmol/L濃度的H2O2，以不添加H2O2對照組細(xì)胞增殖率為100%。結(jié)果顯示:30μmol/L、60μmol/L、90 μmol/L H2O2處理的細(xì)胞增殖率顯著高于 120 μmol/L、150 μmol/L H2O2處理(P＜0.05)(圖 2)。當(dāng)H2O2濃度為90μmol/L時，胚胎干細(xì)胞增殖率降低至50% ～60%。因此，90μmol/L H2O2為最適合建立過氧化氫氧化損傷模型的濃度。

圖2 不同濃度的過氧化氫(H2O2)對胚胎干細(xì)胞的氧化損傷Fig.2 Oxidative damage of embryonic stem cell caused by different concentrations of hydrogen peroxide(H 2O 2)

90μmol/L H2O2處理胚胎干細(xì)胞4.5 h后，分別向培養(yǎng)基中加入 0μmol/L、1.5μmol/L、2.5 μmol/L、3.5 μmol/L、4.5 μmol/L和 5.5 μmol/L亞硒酸鈉，結(jié)果顯示，3.5μmol/L亞硒酸鈉處理的細(xì)胞增殖率顯著高于其他處理(P＜0.05)，且 1.5 μmol/L、2.5 μmol/L、4.5 μmol/L、5.5 μmol/L亞硒酸鈉處理間無顯著性差異(圖3)。表明亞硒酸鈉對90μmol/L H2O2氧化應(yīng)激的最佳保護(hù)濃度則為3.5 μmol/L。

圖3 不同濃度的亞硒酸鈉對過氧化氫氧化損傷下胚胎干細(xì)胞的保護(hù)作用Fig.3 Protective effect of different concentrations of sodiumselenite on embryonic stem cells oxidated by H2 O2

2.3 亞硒酸鈉對不同來源供核細(xì)胞重構(gòu)胚發(fā)育率的影響

采用生長良好的小鼠胚胎干細(xì)胞和皮膚成纖維細(xì)胞做為供核細(xì)胞，生產(chǎn)重構(gòu)胚，統(tǒng)計(jì)其發(fā)育率(表1和圖4)。數(shù)據(jù)顯示，在培養(yǎng)2 d后胚胎干細(xì)胞重構(gòu)胚的胚胎卵裂率顯著高于成纖維細(xì)胞重構(gòu)胚的胚胎卵裂率(P＜0.05)，但兩組間的囊胚率差異不顯著。經(jīng)亞硒酸鈉處理的胚胎干細(xì)胞重構(gòu)胚卵裂率顯著高于未處理的卵裂率(P＜0.05)，兩組間的囊胚率差異也顯著(P＜0.05)。

表1 不同來源供核細(xì)胞重構(gòu)胚的發(fā)育率Table 1 Developmental efficiency of embryonic stem cells of nuclei from different somatic cells

圖4 小鼠胚胎干細(xì)胞重構(gòu)胚的產(chǎn)生過程Fig.4 The process of reconstructed embryos production from embryonic stem cells

2.4 亞硒酸鈉對延邊奶山羊-鼠異種重構(gòu)胚發(fā)育率的影響

結(jié)果(表2)顯示，延邊奶山羊成纖維細(xì)胞構(gòu)成的異種重構(gòu)胚卵裂率和囊胚率顯著低于小鼠成纖維細(xì)胞構(gòu)成的重構(gòu)胚(P＜0.05)。添加亞硒酸鈉濃度為5 ng/ml［11］異種重構(gòu)胚卵裂率顯著高于未添加亞硒酸鈉異種重構(gòu)胚卵裂率(P＜0.05)，囊胚率差異不顯著。

表2 延邊奶山羊-鼠異種重構(gòu)胚的發(fā)育率Table 2 Developmental rates of interspecies reconstructed embryo from Yanbian dairy goat and mouse

2.5 亞硒酸鈉對異種重構(gòu)胚內(nèi)部ROS含量的影響

對2-細(xì)胞、4-細(xì)胞、桑椹胚內(nèi)部的ROS含量進(jìn)行檢測，由表3可知，在2-細(xì)胞期，添加亞硒酸鈉的異種重構(gòu)胚內(nèi)部ROS含量顯著低于未添加亞硒酸鈉處理(P＜0.05);4-細(xì)胞和桑椹胚期，添加亞硒酸鈉的異種重構(gòu)胚內(nèi)部ROS含量與未添加亞硒酸鈉的差異均不顯著。

表3 胚胎內(nèi)部的ROS含量Table 3 Reactive oxygen species(ROS)content inside embryos

3 討論

在體外，培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞條件要求較高，分離培養(yǎng)的過程也比較復(fù)雜，影響環(huán)節(jié)諸多，要做到培養(yǎng)條件與體內(nèi)環(huán)境盡量保持一致。把胚胎從透明帶中孵出是提取胚胎干細(xì)胞的關(guān)鍵，而輔助孵化技術(shù)有助于體外培養(yǎng)的胚胎從透明帶中孵化出。目前，輔助孵化技術(shù)有:機(jī)械法［12］、酶消化法［13-14］、酸化法和激光輔助孵化法［15］。機(jī)械法容易造成囊胚破裂，實(shí)施難度較大。酸化法對操作者的技術(shù)要求較高，并且對細(xì)胞的毒性較大。酶消化法簡單易行，但是對胚胎的損傷很大，并且消化后囊胚不容易貼壁。由于胚胎干細(xì)胞是來自于囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)并且在移植前有一些代謝特點(diǎn)［16］。比如說，在體外培養(yǎng)的胚胎干細(xì)胞自動分化過程可以為檢測細(xì)胞從厭氧到需氧過度的動態(tài)性變化提供一個模型。細(xì)胞就能量供應(yīng)來說氧化磷酸化要優(yōu)于糖酵解［17］。細(xì)胞在體外成熟氧氣較多時，厭氧代謝途徑終止。正在分化或者已經(jīng)分化了的細(xì)胞在有氧條件下用于氧化磷酸化的線粒體有所增加［18］。據(jù)之前報(bào)道，ROS水平過高，會使機(jī)體抗氧化損傷能力下降，從而導(dǎo)致細(xì)胞壞死。濃度過低，可致細(xì)胞凋亡［19-20］。在細(xì)胞里產(chǎn)生ROS的來源有多處，但大部分在線粒體［21］。因此，胚胎干細(xì)胞是檢測抗氧化性的一個良好平臺。本試驗(yàn)首先用外源性H2O2對胚胎干細(xì)胞進(jìn)行氧化損傷，之后采用亞硒酸鈉對胚胎干細(xì)胞的氧化損傷進(jìn)行保護(hù)，測出細(xì)胞增殖率進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，當(dāng)H2O2濃度為90.0μmol/L時，細(xì)胞增殖率較小，對胚胎干細(xì)胞氧化損傷較大，為適宜濃度。亞硒酸鈉對這種氧化應(yīng)激的最佳保護(hù)濃度為3.5μmol/L。

異種重構(gòu)胚技術(shù)，是通過使用分布比較普遍動物的卵母細(xì)胞對瀕臨滅絕動物進(jìn)行重構(gòu)胚，使稀有動物得到延續(xù)的一種方法之一。另外還可通過誘導(dǎo)異種重構(gòu)胚干細(xì)胞分化成卵母細(xì)胞的方法。異種重構(gòu)胚難點(diǎn)在于2個物種的遺傳距離和物種差異可能導(dǎo)致基因組轉(zhuǎn)錄和翻譯的失敗。優(yōu)化異種重構(gòu)胚的培養(yǎng)體系是提高重構(gòu)胚發(fā)育率的方法之一，異種移植有著特定的重構(gòu)胚體系，從而來適應(yīng)供體核的移植，核重塑及重編程。供體核的選擇、融合激活策略的不同、培養(yǎng)體系的改變會對異種重構(gòu)胚的發(fā)育也有著有很大的影響。供體核代數(shù)的不同有著特異的表達(dá)狀態(tài)［22］和 mRNA 表達(dá)模式［23］可能是重編程較差的原因。試驗(yàn)結(jié)果表明，小鼠胚胎干細(xì)胞做為供核細(xì)胞得到的重構(gòu)胚要顯著高于同種的體細(xì)胞移植［24］。有研究表明，用人類神經(jīng)干細(xì)胞做為供核細(xì)胞與山羊卵母細(xì)胞獲得了異種重構(gòu)胚［25］。細(xì)胞成熟促進(jìn)因子是促使核膜破裂、染色體凝集，但是細(xì)胞成熟促進(jìn)因子再激活后會迅速下降到常規(guī)水平。有專家采用卵母細(xì)胞預(yù)先激活［26］和延遲激活［27］的方法提高重構(gòu)胚發(fā)育率。還有研究稱，采用不同培養(yǎng)液(mSOF和 TCM-199)處理喜馬拉雅斑羚-牛的異種重構(gòu)胚培養(yǎng)，結(jié)果mSOF培養(yǎng)液能夠得到囊胚，而TCM-199沒有獲得囊胚［28］。本試驗(yàn)中，亞硒酸鈉處理的小鼠胚胎干細(xì)胞重構(gòu)胚和延邊奶山羊-鼠胎兒皮膚成纖維細(xì)胞異種重構(gòu)胚的卵裂率顯著高于未經(jīng)亞硒酸鈉處理的胚胎干細(xì)胞。

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