王西成， 吳偉民， 趙密珍， 錢亞明， 王壯偉

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，江蘇 南京 210014)

葡萄作為世界第二大水果被廣泛種植和加工利用，為人類社會(huì)的發(fā)展創(chuàng)造了重要的經(jīng)濟(jì)、生態(tài)和社會(huì)效益［1-5］，特別是美國科學(xué)雜志報(bào)道并證明葡萄果實(shí)及其加工產(chǎn)品中特異功能成分白藜蘆醇(Res)含量居各類水果之首［6-7］，進(jìn)一步加速了世界葡萄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。葡萄霜霉病(Grapevine downy mildew)是由葡萄霜霉病菌［Plasmopara viticola(Berk.Et Curtis)Ber.et de Toni］引起的真菌性病害，易于多雨季節(jié)發(fā)生［8］，嚴(yán)重影響葡萄植株的生長及果實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)的提高，給葡萄產(chǎn)業(yè)造成較大經(jīng)濟(jì)損失［9］。到目前為止，葡萄霜霉病的防治仍以傳統(tǒng)的化學(xué)藥劑防治為主［10-11］，這不僅給食品安全帶來隱患，還大幅提高了生產(chǎn)成本，破壞了環(huán)境。隨著病原菌對(duì)殺菌劑抗性的產(chǎn)生，致使殺菌劑的效能大幅下降［12］，這使人們不得不將目標(biāo)集中于更為安全的生物防治技術(shù)上來［13］。因此，深入研究葡萄抗霜霉病的作用機(jī)制具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

近年來，有關(guān)葡萄霜霉病抗性方面的研究已取得了一定的進(jìn)展。在生理生化方面研究發(fā)現(xiàn)，葡萄對(duì)于霜霉病菌抗性的強(qiáng)弱與其自身的組織結(jié)構(gòu)和生理生化特性有著緊密的聯(lián)系，如:Allègre等［14］研究結(jié)果表明，葡萄植株對(duì)于霜霉病菌抗性的強(qiáng)弱與其自身葉片氣孔的數(shù)量、氣孔孔徑、葉片下表皮絨毛及蠟質(zhì)層之間均存在密切聯(lián)系;當(dāng)接種葡萄霜霉病菌后葡萄葉片中過氧化物酶、多酚氧化酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和苯丙氨酸解氨酶的活性均明顯高于接種前［15-16］。此外，接種霜霉病菌后同樣能夠誘導(dǎo)葡萄葉片幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶活性的提高，且這兩種酶活性的提高水平在不同的品種間存在一定的差異［15，17］。在分子方面研究發(fā)現(xiàn)，葡萄抗霜霉病性狀遺傳是主效基因控制的數(shù)量性狀遺傳，抗病主效基因主要存在于我國的野葡萄資源，而抗病微效基因則存在于歐洲葡萄，兩者可通過協(xié)同作用增強(qiáng)植株的抗病性［18-19］。

Ca2+是植物體內(nèi)一種重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)，植物可通過調(diào)節(jié)其濃度變化，積極參與植物體內(nèi)的各種生理生化反應(yīng)過程［20］。如:Ca2+作為應(yīng)答病原菌侵染的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)，可通過一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程誘導(dǎo)防御相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而提高植株自身的抗病性［21］。而由多磷酸肌醇激酶基因/三磷酸肌醇3激酶基因(IPK2/IP3K)所編碼的多磷酸肌醇激酶(IP3-kinase)可通過調(diào)節(jié)三磷酸肌醇(IP3)的水平促使液泡釋放Ca2+，引起胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度的瞬間升高，進(jìn)而起到信息傳遞的作用，參與植株體內(nèi)多種生理生化過程的調(diào)控［22］。據(jù)此分析，IPK2/IP3K基因在提高植株抗病性過程中發(fā)揮著積極作用。目前，已從擬南芥［23］、鹽芥［24］等多種植物中克隆了多磷酸肌醇激酶基因，并且證明了該基因與植物應(yīng)答非生物脅迫過程密切相關(guān)。在葡萄上，盡管已有關(guān)于VvIPK2基因部分序列信息的報(bào)道［25］，但其并未獲得該基因的全長cDNA序列，同時(shí)未對(duì)該基因的序列特征進(jìn)行分析。有鑒于此，本研究以對(duì)霜霉病抗性較強(qiáng)的鮮食葡萄品種金星無核為試驗(yàn)材料，首次獲得了VvIPK2基因全長cDNA序列，并對(duì)其結(jié)構(gòu)特征及其在應(yīng)答霜霉病菌脅迫過程中的表達(dá)模式進(jìn)行了系統(tǒng)分析，以期為進(jìn)一步開展葡萄VvIPK2基因功能研究，探討葡萄抗病的分子機(jī)制提供理論依據(jù)和基礎(chǔ)，同時(shí)也為今后利用基因工程技術(shù)培育抗病葡萄新品種提供可操作的基因資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2012年9月在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院溧水植物科學(xué)基地內(nèi)進(jìn)行，供試葡萄品種為6年生金星無核。葡萄霜霉病病原菌(Plasmopara viticola)于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院院內(nèi)葡萄資源圃病葉上分離獲得。

pMD19-T克隆載體、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、DNaseⅠ酶、Ex-Taq酶、dNTP、熒光染料 SYBR GreenⅠ均購自TaKaRa公司;T4 DNA連接酶購自Promega公司;DNA回收試劑盒、DL 2000 DNA Marker購自上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;DH5α感受態(tài)大腸桿菌(Escherichia coli)菌株由作者所在實(shí)驗(yàn)室保存;各種引物均由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司(http://www.invitrogen.com)合成，其編號(hào)及序列見表1。

1.2 病原菌制備及接種

從田間采回已受霜霉病菌侵染的病葉，先用自來水沖洗干凈，再經(jīng)蒸餾水沖洗后置于20℃黑暗條件下保濕(相對(duì)濕度為95%)24 h，待新孢子囊長出后，用毛刷刷下孢子囊，無菌水配制成1 ml 8×104孢子囊霜霉病菌孢子懸浮液。接種前用載玻片萌芽法測定孢子囊的活性，萌發(fā)率高于85%為有效接種液。

挑選金星無核一年生幼嫩枝條噴施1 ml 8×104孢子囊葡萄霜霉病菌孢子懸液至淋濕狀態(tài)，然后套袋并放入濕棉球保濕，清水處理作對(duì)照。分別于接種后 0 h、4 h、12 h、24 h、48 h、72 h 采集經(jīng)葡萄霜霉病菌侵染的葉片，液氮速凍后，置于-70℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 引物序列、擴(kuò)增片段大小及用途Table 1 Sequence of primers，size of amplified product and their applications

1.3 總RNA的提取及cDNA第一鏈合成

葡萄不同組織及霜霉病菌侵染后不同時(shí)期葡萄葉片總RNA的提取均參考北京華越洋生物科技有限公司生產(chǎn)的植物RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行。以總RNA為模板，利用引物P01反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈，引物P02延伸加帽子，空氣加熱條件下42℃保溫1 h，75℃保溫10 min，冰上冷卻2 min后，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 葡萄VvIPK2基因全長cDNA克隆

根據(jù)GenBank中已登錄的葡萄VvIPK2基因部分cDNA序列，參照王西成等［26］電子克隆方法克隆葡萄VvIPK2基因的全長cDNA序列。以cDNA為模板，利用引物 P03/P04進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，獲得VvIPK2基因的完整ORF序列。反應(yīng)體系(25μl)為引物 P03/P04(10 μmol/L)各 1 μl，Ex-Taq酶 (5 U/μl)0.25 μl，10 × PCR buffer(Mg2+plus)2.5 μl，dNTPMixture(10 mmol/L)2μl，上一步合成的cDNA 2μl，ddH2O補(bǔ)足至25μl。反應(yīng)參數(shù):94℃預(yù)變性5 min;94℃變性40 s，67℃退火40 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的片段用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收，最后將目標(biāo)片段連接到pMD-19T simple載體上進(jìn)行T/A克隆，DNA測序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司(http://www.majorbio.com)完成。

以cDNA為模板，分別利用引物 P05/P06和P07/P08進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得VvIPK2基因的5'和3'非編碼區(qū)(UTR)序列。反應(yīng)體系為25μl:Ex-Taq酶 (5 U/μl)0.25 μl，10 × PCR buffer(Mg2+plus)2.5 μl，dNTP mixture(10 mmol/L)2.0 μl，cDNA 2.0μl，引物 P03/P04或 P05/P06(10μmol/L)各1.0μl，ddH2O補(bǔ)足至25μl。反應(yīng)參數(shù):94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，62℃退火40 s，72℃延伸50 s，共35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min，4℃保存。目的片段的檢測、回收與測序均同上。

1.5 葡萄VvIPK2基因序列分析

利用DNAMAN 5.22軟件對(duì) ORF、5'末端和3'末端3個(gè)序列進(jìn)行拼接分析;核苷酸和氨基酸序列分別利用NCBI的BLASTn和BLASTp(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行相似性分析;用DNAMAN 5.22軟件分析葡萄VvIPK2氨基酸序列與其他植物氨基酸序列的關(guān)系。

1.6 葡萄VvIPK2基因表達(dá)分析

分別提取金星無核葡萄不同組織及接種霜霉病菌后不同時(shí)期的葉片總RNA，經(jīng)DNaseⅠ酶(RNase free)消化后分別取2μg，并以P01和P02引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。利用Primer 3 Input(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)進(jìn)行相關(guān)引物的設(shè)計(jì)，研究該基因在金星無核葡萄中的時(shí)空表達(dá)情況。以葡萄看家基因UBI(GenBank accession number:XM_002266714)作為內(nèi)標(biāo)基因進(jìn)行qRT-PCR分析，目的基因相關(guān)引物序列見表1。qRT-PCR參照已有報(bào)道［26-27］，利用 Bio-Rad My-IQ2熒光定量 PCR 儀，對(duì)目的基因的時(shí)空表達(dá)特性進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析。反應(yīng)體系按照SYBR Green I(TOYOBO)的說明書進(jìn)行，反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性10 s;95℃變性10 s，退火20 s，72℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)，同一樣品共設(shè)置3次重復(fù)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 LinRegPCR［28］和 Excel軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄VvIPK2 cDNA全長的獲得及序列分析

首先以GenBank中已登錄的部分葡萄VvIPK2基因的cDNA序列(JQ429083)為種子序列在葡萄EST數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST檢索，將檢出的與種子序列同源性較高或有部分重疊的EST序列拼接組裝為重疊群(Contig)，再以此Contig為種子序列重復(fù)上述BLAST檢索過程，反復(fù)進(jìn)行EST重疊群序列的拼接和比對(duì)，盡可能獲得葡萄VvIPK2基因的全長cDNA序列。

根據(jù)已獲得的葡萄VvIPK2基因cDNA全長拼接序列設(shè)計(jì)特異引物，進(jìn)而以葡萄不同組織樣品的混合cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得VvIPK2基因的完整ORF序列(圖1A)。同樣根據(jù)電子克隆的序列設(shè)計(jì)特異引物 P05/P06，并利用特異PCR擴(kuò)增，經(jīng)克隆測序獲得該基因的5'末端(圖1B)。在所獲得的ORF內(nèi)設(shè)計(jì)上游引物P07與下游引物P08擴(kuò)增獲得VvIPK2基因的3'末端，包含3'UTR區(qū)和Poly A結(jié)構(gòu)(圖1C)。

圖1 VvIPK2基因ORF(A)、5'末端(B)和3'末端(C)的擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Am p lification of ORF(A)，5'end sequence(B)and 3'end sequence(C)of VvIPK2 gene

測序完成后對(duì)所獲得的VvIPK2基因的5'末端、ORF以及3'末端序列進(jìn)行全長cDNA序列的拼接。拼接結(jié)果顯示該基因的全長cDNA序列為1 853 bp，其中包括918 bp的開放閱讀框(ORF)，615 bp的5'非編碼區(qū)，290 bp的3'非編碼區(qū)，以及30 bp的poly+(A)(圖2)。該基因已提交至NCBI，在Gen-Bank數(shù)據(jù)庫中的登錄號(hào)為:KF752483。該基因ORF區(qū)編碼一個(gè)含305個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，BioXM 2.6預(yù)測VvIPK2所編碼蛋白質(zhì)的分子量為3.421×104，理論等電點(diǎn)(PI)為5.38。

2.2 葡萄VvIPK2基因推導(dǎo)的氨基酸序列同源性分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

為進(jìn)一步分析VvIPK2的進(jìn)化地位，本研究從NCBI公共數(shù)據(jù)庫中下載了擬南芥、鹽芥、大豆和菜豆共4個(gè)物種的IPK2氨基酸序列，用DNAMAN5.22軟件進(jìn)行序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。結(jié)果表明，5條蛋白質(zhì)序列含264～304個(gè)氨基酸殘基，序列之間差異較大，說明該基因在進(jìn)化上并不十分保守，而不同物種間氨基酸序列的差異會(huì)導(dǎo)致其在功能上有所不同(圖3)。

系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，葡萄VvIPK2氨基酸序列與其他物種之間遺傳距離均較遠(yuǎn)，在全部比較的4個(gè)物種中，與擬南芥同源性最高，達(dá)65.23%;與鹽芥同源性次之，為63.56%;而與大豆和菜豆的同源性則分別為54.84%和52.18%(圖4)。

圖2 VvIPK2基因的核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.2 Nucleotide and deduced amino acid sequences of VvIPK2

2.3 葡萄VvIPK2基因在不同組織及不同處理下的表達(dá)

為了解VvIPK2基因在葡萄不同組織，以及葡萄葉片在接種霜霉病菌后不同時(shí)期的表達(dá)情況，本研究以UBI作為內(nèi)參基因，利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)該基因的時(shí)空表達(dá)特征進(jìn)行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該基因在葡萄根、莖、葉、花中均有表達(dá)，但表達(dá)水平存在一定差異。其中，在葉片中的相對(duì)表達(dá)水平最高，根中的相對(duì)表達(dá)水平最低(圖5)。

而在接種霜霉病菌后的72 h內(nèi)，VvIPK2基因的相對(duì)表達(dá)水平均高于對(duì)照(處理0 h)，且呈現(xiàn)出先升高后降低的表達(dá)趨勢。尤其在處理后12 h時(shí)，該基因的相對(duì)表達(dá)水平得到顯著提高，約為對(duì)照樣品表達(dá)量的22.5倍，之后開始逐漸下降，并于處理72 h后降至接近正常水平(圖6)。該結(jié)果表明，霜霉病菌可有效誘導(dǎo)葡萄葉片中VvIPK2基因的上調(diào)表達(dá)。

3 討論

圖3 VvIPK2基因與其他植物IPK2基因推導(dǎo)氨基酸序列的多重比較Fig.3 Alignment of the amino acid sequence of VvIPK2 and IPK2 genes of other plants

圖4 葡萄VvIPK2基因編碼的氨基酸序列與其他物種的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of grapevine and other plants based on the amino acid sequence encoded by VvIPK2

圖5 VvIPK2基因在葡萄不同組織中的表達(dá)水平Fig.5 Expression of VvIPK2 gene in different tissues of grapevine

圖6 霜霉病菌侵染后VvIPK2基因在葉片的表達(dá)水平Fig.6 Expression of VvIPK2 gene in grapevine infected by Plasmopara vitieola

葡萄霜霉病遍及世界各個(gè)葡萄產(chǎn)區(qū)，是葡萄生產(chǎn)上重要的真菌性病害之一［17，29］。霜霉病菌主要危害葡萄葉片，在發(fā)病初期可通過侵染葉片形成不規(guī)則黃褐色斑塊，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致葉片干枯脫落，大幅降低植株的光合效率;而當(dāng)進(jìn)入發(fā)病后期時(shí)，還可進(jìn)一步侵染葡萄嫩稍、葉柄、幼果等部位，直接導(dǎo)致減產(chǎn)30% ～50%，重者甚至減產(chǎn) 80%以上［15，30］。鑒于葡萄霜霉病給世界葡萄產(chǎn)業(yè)發(fā)展所帶來的嚴(yán)重影響，積極開展葡萄抗病新品種選育工作就顯得尤為重要。Keen等［31］認(rèn)為植物的抗病性是植物為了抵抗病原物的侵染、擴(kuò)展和危害而在形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理生化，以及時(shí)間和空間上的綜合表現(xiàn)，其實(shí)質(zhì)是抗病相關(guān)基因表達(dá)的結(jié)果。而葡萄作為世界性重要果樹，積極研究其中蘊(yùn)含的豐富基因，特別是抗病基因具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。

在葡萄抗霜霉病基因研究方面，Luo等［32］首先通過RAPD標(biāo)記技術(shù)發(fā)現(xiàn)了與葡萄抗霜霉病主效基因緊密連鎖的RAPD標(biāo)記OPO06-1500，并證明該抗病標(biāo)記在中國野生種株系中均存在。Fischer等［18］通過SSR技術(shù)定位了一個(gè)抗霜霉病的微效基因VvMD27。Kortekamp等［33］則通過差異顯示技術(shù)對(duì)接種葡萄霜霉菌12 h的抗病河岸葡萄(Vitis riparia)Gloire de Montpellier和感病歐洲葡萄Riesling進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)并分離到一個(gè)定位于10號(hào)連鎖群的VRP-1抗病基因。Di等［34］通過對(duì)歐洲葡萄染色體連鎖圖譜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了分布在7個(gè)連鎖群上的82個(gè)抗病基因相似序列(RGA)標(biāo)記，其中部分標(biāo)記可定位在染色體的控制抗病表型的區(qū)域。而王沛雅等［35］則以中國原產(chǎn)抗霜霉病葡萄野生種華東葡萄(Vitis pseudoreticulata)白河-35-1為材料，利用SMARTTM技術(shù)成功構(gòu)建了由葡萄霜霉菌(Plasmopara viticola)誘導(dǎo)的葡萄葉片cDNA文庫，進(jìn)一步對(duì)文庫中所得已知功能的ESTs進(jìn)行蛋白功能預(yù)測分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了部分編碼抗病防御蛋白相關(guān)的基因。

鑒于多磷酸肌醇激酶基因在植物逆境脅迫過程中所發(fā)揮的重要作用［23-25，36］，本研究在已有的葡萄多磷酸肌醇激酶基因片段的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步利用電子克隆結(jié)合RACE技術(shù)成功地從金星無核葡萄中分離到一個(gè)葡萄VvIPK2基因的全長cDNA序列。序列分析結(jié)果表明，該基因與多種植物已知氨基酸序列的同源性為52.18% ～65.23%，說明該基因在進(jìn)化上具有并不十分保守的特點(diǎn)。盡管該基因在葡萄各個(gè)組織中均有表達(dá)，但其在葉片和莖中的表達(dá)水平要稍高于根和花，這與霜霉病菌主要危害葡萄葉片，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)侵染嫩梢的特性之間可能存在某種程度的關(guān)聯(lián)。病菌接種試驗(yàn)結(jié)果表明，葡萄葉片在受霜霉病菌侵染后的72 h內(nèi)，VvIPK2基因的表達(dá)水平始終高于對(duì)照葉片(處理0 h)，且在接種后12 h時(shí)該基因的相對(duì)表達(dá)水平達(dá)到最高值，為對(duì)照的22.5倍，遠(yuǎn)高于高超等［25］所獲得的高于正常水平12倍的研究結(jié)果，說明VvIPK2基因積極參與了葡萄應(yīng)答霜霉病的過程。

總之，本研究通過分離葡萄多磷酸肌醇激酶基因VvIPK2的全長cDNA序列，并對(duì)其序列特征和時(shí)空表達(dá)特點(diǎn)進(jìn)行了初步研究，發(fā)現(xiàn)該基因可能在葡萄應(yīng)答霜霉病菌侵染過程中發(fā)揮著重要的作用，這為進(jìn)一步通過基因工程手段驗(yàn)證其功能，進(jìn)而從分子水平上揭示葡萄對(duì)于霜霉病的抗性機(jī)理提供了重要的理論參考。

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