張麗珠，于 璐，梁 坤，谷利軍，樊保敏，楊麗娟

（1. 云南民族大學(xué) 國(guó)家民委-教育部民族藥資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500；2. 西南林業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，云南 昆明 650224）

羅丹明汞離子熒光探針的合成及光譜研究

張麗珠1，于 璐1，梁 坤2，谷利軍1，樊保敏1，楊麗娟1

（1. 云南民族大學(xué) 國(guó)家民委-教育部民族藥資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500；2. 西南林業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，云南 昆明 650224）

通過(guò)硫的親汞性和氨基硫脲衍生物能被Hg2+轉(zhuǎn)化為胍衍生物的機(jī)理，合成了一種新的Hg2+探針3′，6′-二乙氨基-2，7-二甲基-2-（N-氨基乙基）螺［異吲哚-1，9′-呫噸］-3-硫酮（R6G1）?？疾炝颂结楻6G1的水溶性、光譜性能及其在水相中對(duì)常見(jiàn)離子的選擇性，測(cè)定了探針R6G1與Hg2+的絡(luò)合比例和絡(luò)合常數(shù)。水溶液中金屬陽(yáng)離子選擇性測(cè)試結(jié)果表明，探針R6G1的水溶性好，能高選擇性地識(shí)別Hg2+，該識(shí)別過(guò)程不受Fe3+，Cu2+，Al3+，Cr3+，F(xiàn)e2+，Mn2+，Co2+，Pb2+，Mg2+，Ca2+，Cd2+，Zn2+，Ba2+等金屬陽(yáng)離子和F-，Cl-，Br-等陰離子的干擾。紫外滴定結(jié)果表明，探針R6G1與Hg2+按1∶1的化學(xué)計(jì)量比絡(luò)合。熒光滴定測(cè)試結(jié)果表明，探針R6G1識(shí)別Hg2+的絡(luò)合常數(shù)lgKa=5.92。

羅丹明；熒光探針；汞離子；光譜性能

汞是一種危害人體健康的重金屬元素［1］，通常環(huán)境中的汞主要來(lái)自于火山噴發(fā)和地質(zhì)風(fēng)化，然而隨著工業(yè)化的不斷發(fā)展，環(huán)境中汞的排放則主要來(lái)自于人類活動(dòng)。汞在自然界中主要以單質(zhì)汞、無(wú)機(jī)汞和有機(jī)汞3種形式存在，通過(guò)生物的富集作用，進(jìn)到食物鏈中，人體吸收過(guò)量的Hg2+后會(huì)導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肝、腎和腸道的損害，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)鹚劳觯?-3］。因此，生物體和環(huán)境中Hg2+的檢測(cè)十分重要。近年來(lái)，檢測(cè)Hg2+的方法主要有原子吸收-發(fā)射光譜法、分光光度法、高效液相色譜法、電化學(xué)法和熒光分析法等［4-7］。其中，熒光分析法因具有便捷、專一、靈敏和適時(shí)原位檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注。雖然目前有關(guān)檢測(cè)Hg2+的熒光探針報(bào)道［8-12］較多，且大多數(shù)Hg2+探針都能做到單一地高選擇性和高靈敏度識(shí)別，但由于受到一些重要因素（如探針配體水溶性差等）的限制，目前有關(guān)能在水相中檢測(cè)Hg2+且不受溶液中陽(yáng)離子和陰離子干擾的探針的報(bào)道還較少［9，13］。

本工作合成了一種新的Hg2+探針3′，6′-二乙氨基-2，7-二甲基-2-（N-氨基乙基）螺［異吲哚-1，9′-呫噸］-3-硫酮（R6G1）；考察了探針R6G1的水溶性、光譜性能及其在水相中對(duì)常見(jiàn)離子的選擇性；測(cè)定了探針R6G1與Hg2+的絡(luò)合比例及絡(luò)合常數(shù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

400 MHz型核磁共振儀：Brucker公司；Saturn 2200/2100型液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀和Cary Eclipse型熒光分光光度計(jì)：Varian公司；8453型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：Agilen公司。

羅丹明6G、勞森試劑、甲苯、甲醇、二氯甲烷、水合肼：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 探針R6G1的合成

以羅丹明6G為原料，利用硫的親汞性和氨基硫脲衍生物能被Hg2+轉(zhuǎn)化為胍衍生物的原理，合成了R6G1，合成路線見(jiàn)式（1）。其中，3′，6′-二乙氨基-2，7-二甲基-2-（N-氨基乙基）螺［異吲哚-1，9′-呫噸］-3-酮（化合物Ⅰ）按文獻(xiàn)［15］報(bào)道的方法合成。將5.5 g化合物Ⅰ和2.5 g勞森試劑加入到圓底燒瓶中，N2保護(hù)下加入35 mL甲苯，緩慢升溫至回流，6 h后停止加熱，冷卻至室溫。蒸出甲苯，粗產(chǎn)物用體積比為100∶3的二氯甲烷和甲醇的混合溶液（作為洗脫液）進(jìn)行柱層析，得到白色固體（即R6G1）1.53 g，收率為26%。

Compound Ⅰ：3′，6′-diethylamino-2，7-dimethyl-2-(N-aminoethyl)spiro［isoindoline-1，9′- xanthene］-3-ketone；R6G1：3′，6′-diethylamino-2，7-dimethyl-2-(N-aminoethyl)spiro［isoindoline-1，9′-xanthene］-3-thione.

1.3 光譜實(shí)驗(yàn)

經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，探針R6G1具有良好的水溶性，這為探針R6G1在水體系中的應(yīng)用提供了可能。因此，探針R6G1的熒光光譜和紫外吸收光譜均在三羥甲基氨基甲烷（Tris）-HCl（pH=7）的緩沖溶液中測(cè)試。溶液中探針R6G1的濃度為5 μmol/L，加入的各離子的濃度為200 μmol/L。激發(fā)波長(zhǎng)為510 nm，激發(fā)狹縫為2.5 nm，發(fā)射狹縫為5 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 離子的選擇性和光譜性能測(cè)試

探針R6G1是按照硫的親汞性設(shè)計(jì)合成的，因此在濃度為5 μmol/L的R6G1溶液中加入濃度為200 μmol/L的Hg2+，F(xiàn)e3+，Cu2+，Al3+，Cr3+，F(xiàn)e2+，Mn2+，Co2+，Pb2+，Mg2+，Ca2+，Cd2+，Zn2+，Ba2+，K+，Ni2+，以考察探針R6G1的離子選擇性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)，加入Hg2+后R6G1的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，加入Fe3+和Cu2+后R6G1的熒光強(qiáng)度略有增強(qiáng)，而加入其他金屬離子對(duì)R6G1的熒光強(qiáng)度幾乎無(wú)影響。這與本工作的設(shè)計(jì)理念吻合。

水相中Hg2+濃度變化與探針R6G1相互作用的熒光滴定曲線見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn)，未加入Hg2+時(shí)，R6G1的熒光強(qiáng)度幾乎為零，表明此時(shí)探針R6G1為閉環(huán)狀態(tài)。加入Hg2+后，在566 nm處出現(xiàn)一個(gè)新的熒光特征峰，且熒光強(qiáng)度隨Hg2+濃度的增大而增強(qiáng)，表明R6G1內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)的打開(kāi)產(chǎn)生了熒光，且熒光強(qiáng)度的增幅與Hg2+濃度呈線性關(guān)系，溶液顏色也由無(wú)色逐漸變成粉紅色。

圖1 探針R6G1的離子選擇性Fig.1 Ion selectivity of the probe R6G1.

圖2 水相中Hg2+濃度變化與探針R6G1相互作用的熒光滴定曲線Fig.2 Fluorometric titration curves of the interaction between the probe R6G1 and Hg2+ concentration change in aqueous solution.

為考察探針R6G1與Hg2+的絡(luò)合比例和檢測(cè)靈敏度，測(cè)試了探針R6G1與Hg2+結(jié)合的紫外吸收光譜的Job-Plot曲線（見(jiàn)圖3）和絡(luò)合常數(shù)（Ka）。由圖3可見(jiàn)，R6G1與Hg2+是按1∶1的化學(xué)計(jì)量比絡(luò)合的?；诖私j(luò)合比例，計(jì)算得到lgKa=5.92，表明探針R6G1具有較高的靈敏度。

為考察其他金屬陽(yáng)離子和陰離子對(duì)探針R6G1鑒別Hg2+的影響，還進(jìn)行了其他金屬陽(yáng)離子和陰離子的干擾實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖3 R6G1與Hg2+結(jié)合的紫外吸收光譜的Job-Plot曲線Fig.3 Job-Plot curves of the ultraviolet absorption spectrum of R6G1 and Hg2+.

圖4 金屬陽(yáng)離子和陰離子對(duì)Hg2+識(shí)別的干擾Fig.4 Competition experiments of Hg2+ with other metallic ions and anions.

由圖4（a）可見(jiàn)，在濃度為5 μmol/L的R6G1溶液中加入濃度為200 μmol/L的其他金屬陽(yáng)離子后，熒光強(qiáng)度幾乎沒(méi)有變化，之后再加入Hg2+，熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)；除Cu2+，Al3+，Cr3+，F(xiàn)e3+外，加入其他金屬陽(yáng)離子后R6G1的熒光強(qiáng)度的增幅與單獨(dú)加入Hg2+后R6G1的熒光強(qiáng)度的增幅相同，表明其他金屬陽(yáng)離子的存在未干擾R6G1對(duì)Hg2+的檢測(cè)。而Cu2+，Al3+，Cr3+，F(xiàn)e3+的加入使得R6G1的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)則可能是因?yàn)楦邼舛认?，這4種金屬陽(yáng)離子發(fā)生水解使緩沖能力有限的Tris-HCl溶液的pH略有降低，較低的pH使得R6G1的酰胺結(jié)構(gòu)部分開(kāi)環(huán)，從而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。

由圖4（b）可見(jiàn)，添加陰離子后，除I-的加入使熒光強(qiáng)度下降外，其他陰離子對(duì)熒光強(qiáng)度的影響不大，而I-的加入使熒光強(qiáng)度下降可能是由于I-與Hg2+形成了［HgI4］2+，從而使Hg2+無(wú)法正常與R6G1結(jié)合所致，這與文獻(xiàn)［12］報(bào)道的結(jié)果基本一致。

2.2 體系pH對(duì)探針R6G1的影響

考察體系pH對(duì)探針R6G1和R6G1識(shí)別Hg2+后熒光強(qiáng)度的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可見(jiàn)，探針R6G1在較寬的pH范圍（3.5～12.0）內(nèi)主要以螺環(huán)形式存在，其水溶液既無(wú)顏色又無(wú)熒光，通過(guò)Sigmoidal擬合計(jì)算得pKa=2.52±0.07，表明探針R6G1是一種對(duì)pH不敏感的熒光分子。由圖5還可見(jiàn)，當(dāng)R6G1識(shí)別Hg2+后，盡管熒光強(qiáng)度變化較大，但并不影響探針在酸性和中性環(huán)境中對(duì)Hg2+的識(shí)別，該測(cè)試結(jié)果為探針R6G1在實(shí)際環(huán)境中的應(yīng)用創(chuàng)造了很好的條件。

圖5 R6G1和R6G1+Hg2+的pH滴定結(jié)果Fig.5 pH titrations of the R6G1 system and the R6G1+ Hg2+ system.

2.3 反應(yīng)機(jī)理的探討

為進(jìn)一步研究探針R6G1與Hg2+的絡(luò)合機(jī)理，根據(jù)文獻(xiàn)［14］報(bào)道的氨基硫脲衍生物能被Hg2+轉(zhuǎn)化為胍衍生物的機(jī)理，可以推測(cè)出R6G1與Hg2+進(jìn)行絡(luò)合反應(yīng)的可能機(jī)理（見(jiàn)圖6），即隨Hg2+的加入，Hg2+與S結(jié)合生成HgS沉淀，從而得到3′，6′-二乙氨基-2，7-二甲基-2-（N-苯基）-［6H-呫噸］咪唑（R6G3），并對(duì)R6G3進(jìn)行了MS表征，從表征結(jié)果可確定所得產(chǎn)物為R6G3。

圖6 R6G1與Hg2+進(jìn)行絡(luò)合反應(yīng)的可能機(jī)理Fig.6 Proposed mechanism for the complexing reaction of R6G1 with Hg2+.

3 結(jié)論

1）以羅丹明6G為原料，利用硫的親汞性設(shè)計(jì)合成了Hg2+探針R6G1，并對(duì)R6G1進(jìn)行了1H NMR，13C NMR，MS表征，證明合成產(chǎn)物為所設(shè)計(jì)的目標(biāo)化合物。

2）測(cè)試探針R6G1對(duì)離子的選擇性時(shí)發(fā)現(xiàn)，R6G1能在水相中檢測(cè)Hg2+，與Hg2+結(jié)合后熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)；R6G1與Hg2+的絡(luò)合常數(shù)lgKa=5.92，表明探針R6G1在水溶液中的選擇性好，靈敏度高且不受其他金屬陽(yáng)離子的干擾。

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（編輯 李明輝）

Synthesis and Spectrum of Mercury Ion Fluorescent Probe Based on Rhodamine Dyes

Zhang Lizhu1，Yu Lu1，Liang Kun2，Gu Lijun1，F(xiàn)an Baomin1，Yang Lijuan1
（1. Key Laboratory of Chemistry in Ethnicmedicinal Resources，State Ethnic Affaira Commission ＆ Ministry of Education，Yunnan University of Nationalities，Kunming Yunnan 650500，China；2. Faculty of Science，Southwest Forestry University，Kunming Yunnan 650224，China）

A Hg2+fluorescence probe，3′，6′-diethylamino-2，7-dimethyl-2-(N-aminoethyl)spiro［isoindoline-1，9′-xanthene］-3-thione(R6G1)，was synthesized through the strong thionic affinity with Hg2+and the transformation of thiourea derivatives to guanidine derivatives by the promotion of Hg2+. The water solubility，spectrum and ion selectivity of R6G1 were investigated. The complexing ratio of Hg2+to R6G1 and the complexation constant were measured through fluorometric titration.The results showed that the probe R6G1 had high selectivity to Hg2+and good water solubility. The recognition process of R6G1 to Hg2+was not affected by other metal ions such as Fe3+，Cu2+，Al3+，Cr3+，F(xiàn)e2+，Mn2+，Co2+，Pb2+，Mg2+，Ca2+，Cd2+，Zn2+，Ba2+，and anions such as F-，Cl-，Br-.Spectrophotometric titration indicated that the complex of Hg2+and R6G1 formed with the ratio of 1∶1 and the complexation constant(lgKa) was 5.92.

rhodamine； fl uorescent probe；mercury ion；spectral properties

1000 - 8144（2014）04 - 0461 - 05

TQ 426.91

A

2013 - 11 - 18；［修改稿日期］2014 - 01 - 20。

張麗珠（1973—），女，四川省成都市人，博士，副教授，電話 13508716745，電郵 zhanglizhu333@163.com。聯(lián)系人：樊保敏，電話13888070271，電郵 adams.bmf@hotmail.com。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（21162040，21162042）。