孫紫薇，雷 燦，鄭小江，2*

(1.湖北民族學院林學園藝學院，湖北恩施445000;2.湖北民族學院生物科學與技術學院，湖北恩施445000)

淫羊藿是我國最著名的中草藥之一，在日本、朝鮮以及地中海地區(qū)也被作為藥用植物［1－2］.2002年，我國衛(wèi)生部頒布實施的《關于進一步規(guī)范保健食品原料管理的通知》將淫羊藿列入可用于保健食品的中草藥名單.對一些具有顯著保健功效的中草藥進行藥食兼用食品研究開發(fā)也是中藥現(xiàn)代化的一個重要發(fā)展方向.淫羊藿含有黃酮類、多糖、生物堿、木脂素、萜類、綠原酸、必需脂肪酸、苯類化合物和微量元素等多種營養(yǎng)成分和生物活性物質，具有抗骨質疏松、抗氧化、調節(jié)免疫等藥理活性［3］.以淫羊藿苷為主的黃酮類化合物是淫羊藿的主要活性成分，主要是因為淫羊藿中黃酮類化合物具有雌激素樣作用，對人體生理代謝具有重要的調節(jié)功能［4］.2005年《中華人民共和國藥典》規(guī)定，淫羊藿藥材來源為小檗科淫羊藿屬的淫羊藿(Epimedium brevicornum)、箭葉淫羊藿(E.sagittatum)、巫山淫羊藿(E.wushanense)、柔毛淫羊藿(E.pubescens)和朝鮮淫羊藿(E.koreanum)五個種.然而，淫羊藿屬植物在我國廣泛分布，達45種之多，多為狹布種［5］.幾乎全國各地都采集當?shù)匾吧蜣阶鳛樗幉某鍪刍蛘呷胨?各地野生淫羊藿以淫羊藿苷為主的黃酮類化合物含量差異顯著.由此導致各地采收的淫羊藿藥材的質量不一致，嚴重影響其質量標準.

中藥材質量控制和藥材標準化是中藥現(xiàn)代化的最基礎性研究工作.藥材混亂或質量參差不齊嚴重制約著我國中藥產業(yè)的發(fā)展效益和國際市場開拓.基于此，我國已經先后建立了多個中藥材GAP基地，如橘梗、北沙參、板藍根、人參、紅花、柴胡、太子參、遠志、云木香、黃芪、黃芩、車前等等［6］.但是，關于淫羊藿的GAP研究，雖然近些年來有較多的研究報道，但是大多集中在:活性成分的鑒定和檢測方法、藥理學研究、個別種內或種間的活性成分變化研究、生態(tài)環(huán)境的研究等等.關于淫羊藿市售藥材的質量現(xiàn)狀和藥典規(guī)定的五個淫羊藿物種的活性成分差異以及種內活性成分變異尚未有系統(tǒng)研究報道.基于此本文進行了相關研究，為淫羊藿這一著名中藥材的資源利用、種質改良和GAP研究提供理論依據(jù).

1 試驗儀器和藥品

STI501高效液相色譜儀(杭州賽智科技);STI UV501紫外可見檢測器;Lichrospher C18色譜柱(4.6×250 mm，江蘇漢邦科技);N2000色譜工作站和STI501泵;紫外可見分光光度計UV756CRT(上海佑科儀器公司);超聲波發(fā)生器(深圳潔泰超聲清洗公司，PS－40，40 kHz，240 w);電子分析天平以及其它實驗室常用設備.乙腈(HPLC級);乙酸(分析純).淫羊藿苷、朝藿定A，B，C標準品購自中國藥品與生物制品檢定所.

2 試驗方法

2.1 分析條件

供試品溶液的制備:干燥淫羊藿樣品制備前在80℃烘干至恒重，然后粉碎，過60目藥典篩，所得粉末用于樣品分析.成分提取參照張華峰等［7］，略作修改:精密稱取淫羊藿藥材粉末約1.0 g，加入50%乙醇20 mL，稱重，超聲提取1 h，冷卻至室溫，稱重，補重，濾過，如此循環(huán)提取三次，合并濾液，過0.22 μm濾膜，作為供試品溶液.標準曲線的建立:用70%乙醇分別溶解朝藿定A、B、C和淫羊藿苷標準品，配成梯度濃度的對照品采用外標法，通過測定各成分相應的峰面積與該成分的質量的比值建立標準曲線，結果見表1.

表1 HPLC分析淫羊藿苷、朝藿定A、B、C標準曲線數(shù)據(jù)Tab.1 Data of calibration curv for HPLC determination on Icariin and EpimedinA，B，and C

精密度試驗:混合對照品溶液連續(xù)進樣5次，朝藿定A，B，C及淫羊藿苷的峰面積值的RSD%分別為1.55%、1.24%、1.03%、1.27%，精密度良好.此外重復性 RSD%在0.92% ～1.87%.穩(wěn)定性 RSD%在1.31% ～3.88%.說明建立的方法重復性良好，方法可行，樣品具有較好的穩(wěn)定性.回收率在95.65% ～102.17%，說明在該儀器系統(tǒng)內該方法具有良好的準確度.

淫羊藿藥材總黃酮的測定，采用藥典規(guī)定的方法:提取液在270 nm下測定，以淫羊藿苷為標準品計算總黃酮含量.以淫羊藿苷為標準品計算出的標準方程為:Y=44.873X+0.025，R2=0.9998，在5.02% ～15.36 μg/mL范圍內呈規(guī)律性的線性關系.

2.2 各地藥材的采集和分析

在浙江杭州、湖北武漢、安徽毫州、河南信陽、青海西寧、內蒙古巴盟、陜西周至、甘肅蘭州、湖北恩施、重慶涪陵等地中藥材店購買淫羊藿藥材飲片，按照本文2.1樣品制備方法進行制備提取.

根據(jù)藥典描述和中國植物志描述的特征，野外采集藥典規(guī)定的五個淫羊藿物種的盛花期葉片硅膠干燥備用.以巫山淫羊藿為例，采集湖北巴東、湖北恩施大峽谷、湖北恩施望城坡、湖北建始縣、湖北宣恩縣、湖南龍山縣、重慶巫山縣、湖北神農架木魚鎮(zhèn)、貴陽等地的巫山淫羊藿盛花期葉片，硅膠干燥，按照本文2.1樣品制備方法進行制備提取.

3 結果與分析

3.1 市場流通的淫羊藿藥材中的淫羊藿苷等四個成分差異顯著

杭州購買的淫羊藿藥材的淫羊藿苷和總黃酮含量最高，分別達到1.62%、9.66%，如表2所示.達到或超過藥典規(guī)定標準(淫羊藿苷不低于0.50%)的樣品有:毫州、涪陵、恩施、周至、貴陽、杭州.其他地方收集的樣品淫羊藿苷的含量則低于藥典標準.恩施、蘭州、西寧、巴盟和周至的淫羊藿藥材總黃酮含量也低于藥典標準(總黃酮不低于5.0%).這說明市場流通的淫羊藿藥材質量差異顯著.各地淫羊藿藥材的來源各異，有些地方基本上來自地方農民采集，物種混雜，含量不一，這些可能導致藥材質量差異.

3.1 藥典規(guī)定的5個種藥材主要成分差異顯著

如表3所示，在這5個物種中，朝藿定C含量均最高，其中以巫山淫羊藿總黃酮含量最高.而藥典規(guī)定的淫羊藿苷的含量在5個物種中均較低，且差異較大，其中巫山淫羊藿的淫羊藿苷含量顯著高于其他4個物種.朝藿定C是淫羊藿種最豐富的活性成分之一，同樣具有重要的藥理活性［8］，本研究中朝藿定C在淫羊藿藥材中的含量最高，因此在種植資源選育研究中，應該重點考慮朝藿定C的含量標準.5個物種的主要成分含量差異顯著，說明淫羊藿藥材質量提高有很大的潛力，種質篩選和藥材進一步標準化研究非常必要.

3.3 巫山淫羊藿不同地點的植株主要黃酮組成及含量差異顯著

采自湖北巴東、湖北大峽谷、湖北望城坡、湖北建始縣、湖北宣恩縣、湖南龍山縣、重慶巫山縣、湖北神農架木魚鎮(zhèn)等地點的巫山淫羊藿4種主要黃酮的組成和含量以及總黃酮含量存在顯著的差異，如圖1和表4所示.

表2 部分地區(qū)市場流通淫羊藿藥材的主要活性成分含量Tab.2 Contents of the main active components of Epimedium drugs from different markets

表3 藥典五個種藥材的主要成分含量Tab.3 Contents of the main active components of five species stated by China pharmacopoeia

圖1 巫山淫羊藿不同個體中四種主要成分典型差異(1－朝藿定A;2－朝藿定B;3－朝藿定C;4－淫羊藿苷)Fig.1 Chromatogram map of Icariin and Epimedin A，B，and C from different plants of Epimedium wushanense

巫山淫羊藿不同地點的樣品主要成分含量差異極顯著，淫羊藿苷0% ～1.53%，4種黃酮總量 1.47% ～5.48%，總黃酮3.56% ～8.25%.而且不同植株的4種成分組成也存在典型的差異，表現(xiàn)為在某些植株中無法檢出.

這表明種內存在著與主要活性成分相關的的遺傳變異.因此在種內全面調查和采集資源，并在此基礎上進行同園栽培以篩選優(yōu)良種質，再在獲得優(yōu)良種質的基礎上進行輻射誘變、化學誘變、雜交等方法進行育種，可望獲得高含量、穩(wěn)定的新品系，進而推廣，實現(xiàn)淫羊藿藥材的品種標準化和質量可控化.沒有品種標準化和藥材標準化，就不會有中藥材現(xiàn)代化.

表4 不同地點巫山淫羊藿的4種主要黃酮含量差異Tab.4 Contents of the main active components of Epimedium wushanense from different locations

4 結論

1)目前淫羊藿藥材來源仍舊停留于利用野生藥材，導致來源不清，含量不穩(wěn)，給藥材的療效和中藥企業(yè)帶來很大的影響.中藥現(xiàn)代化要求大量的標準化原藥材供應，因此，人工干預的品種標準化藥材資源生產是必由之路，是中藥材質量管理規(guī)范的基礎工作.盡管有些企業(yè)在開始嘗試建立淫羊藿GAP基地，對于推進淫羊藿藥材質量穩(wěn)定有重要意義，然而，缺乏種質資源研究基礎以及相應的優(yōu)質穩(wěn)定的品種，藥材質量難以有質的提高.

2)研究證明，在淫羊藿屬內五個物種的淫羊藿苷等黃酮類化合物相關的遺傳背景存在極顯著的差異，這為淫羊藿優(yōu)良種質的培育提供了很大的空間，也表明了淫羊藿屬物種的資源普查的必要性.我國在上世紀60年代進行了甾體化合物植物資源普查并篩選出皂素含量最豐富的物種—盾葉薯蕷(Dioscorea zingiberensis C.H.Wright)，從而引起了我國皂素產業(yè)的蓬勃發(fā)展，這就是中藥材種質資源研究的一個典型例子.

3)隨著中藥產業(yè)的迅速發(fā)展，靠野生資源供應已經不可能持續(xù)發(fā)展，人工干預的野生護育和大規(guī)模種植是必然趨勢.培育優(yōu)良品種可從源頭上解決中藥材的質量控制問題.借鑒農林作物的模式走中藥材品種標準化和種植標準化(GAP)是我國中藥產業(yè)的必經之路.基于此，相應藥材原植物的遺傳資源調查研究就顯得更加重要.篩選出優(yōu)良的種質，就有了育種的物質基礎.本文以淫羊藿為個案，對藥典規(guī)定的藥材進行比較研究，籍以為藥典信息更正、中藥標準化的基礎研究的重要性提供一個佐證，以及對其他中藥材資源的現(xiàn)代化研究提供一個借鑒.

［1］ De Naeyer A，Pocock V，Milligan S，et al.Estrogenic activity of a polyphenolic extract of the leaves of Epimedium brevicornum［J］.Fitoterapia，2005，76(1):35 －40.

［2］ Wang Y K，Huang Z Q.Protective Effects of Icariin on Human Umbilical vein Endothelial Cell Injury Induced by H2O2in Vitro［J］.Pharmacological Research，2005，52(2):174 －182.

［3］ Zhang H F，Yang X H.Broblems and Countermeasures for quality control if Epimedium［J］.Chinese berbal medicine，2009，40(1):160 －163.

［4］ P Shen，BL Guo，Y Gong，et al.Taxonomic，genetic，chemical and estrogenic characteristics of Epimedium species［J］.Phytochemistry，2007，68(10):1448－1458.

［5］ Ren L，Dai S L，Wang Y.Epimedium germplasm resources and landscepe application［J］.Wuhan Botany institution，2008，26(6):644 －649.

［6］ Huang J Y，Wang H D，Song M X.GAP base of China medicine research［J］.Modern Chinese Medicine Research and Practice，2011，25(4):6 －10.

［7］ Zhang H F，Yang TS，Li Z Z，Wang Y.Simultaneous extraction of epimedin A，B，C and icariin from Herba Epimedii by ultrasonic technique［J］.Ultrasonics sonochemistry，2008，15:376 －385.

［8］ Chen X J，Guo B L，Li S P，et al.Simultaneous determination of 15 flavonoids in Epimedium using pressurized liquid extraction and high － performance liquid chromatography［J］.Journal of Chromatography A，2007，1163:96 －104.