潘奇 陳萬勇 朱凱 張巨波 趙一鳴 朱小東 孫惠川 王魯 任寧

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝外科，上海 200032)

在腫瘤病死原因中，原發(fā)性肝癌已居世界第3位、中國第2位［1-2］。前期的動物研究［3］發(fā)現(xiàn)，干擾素α可顯著地抑制肝癌的生長、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā);之后的臨床隨機對照試驗［4］也證實干擾素α可以減少和推遲肝癌切除術(shù)后的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，但具體的調(diào)控機制仍不清楚。轉(zhuǎn)錄因子Sp1(specificity protein 1)是序列特異性的DNA結(jié)合蛋白，參與調(diào)控多種基因的轉(zhuǎn)錄［5］。近年來研究［6-7］發(fā)現(xiàn)，Sp1 在腫瘤組織中有異常表達和活化。本研究采用蛋白免疫印跡(Western blotting，WB)法和凝膠電泳遷移率變動分析(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)法研究干擾素α對肝癌細(xì)胞內(nèi)Sp1的表達及活性的影響，以探討干擾素α治療肝癌的可能機制。

1 資料與方法

1.1 細(xì)胞株 人肝癌細(xì)胞系MHCC97H由復(fù)旦大學(xué)肝癌研究所保存和培養(yǎng)。

1.2 主要試劑 高糖DMEM培養(yǎng)液(美國Gibco-BRL公司)，特級胎牛血清(40 nm過濾，美國Hyclone公司)，0.25%胰蛋白酶、0.02%EDTA 消化液(美國Difco公司)。干擾素α1b(深圳科興生物工程有限公司);細(xì)胞總蛋白和核蛋白抽提試劑盒(美國Panomics公司);蛋白濃度檢測試劑盒(Bradford法，上海申能博彩生物科技有限公司);EMSA combo試劑盒(美國Panomics公司);Western blotting試劑盒(美國 Millipore公司);大鼠抗人 Sp1(PEP2，sc59)多克隆抗體(美國Santa Cruz公司);大鼠抗人磷酸化Sp1(Thr739)多克隆抗體(美國Centre Antoine公司);辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗大鼠IgG(上?？党缮锕こ逃邢薰?。

1.3 實驗方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物干預(yù)、細(xì)胞總蛋白及核蛋白抽提 MHCC97H細(xì)胞用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)，每隔3～5 d傳代1次。將對數(shù)生長期的MHCC97H細(xì)胞分為5組，各組細(xì)胞分別用不含干擾素的10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液及分別含干擾素5、10、30、50 ng/mL的無血清 DMEM 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)20 min，進行后續(xù)實驗。按照試劑盒說明抽提細(xì)胞總蛋白及核蛋白，采用Bradford法測定蛋白濃度。

1.3.2 EMSA法檢測干擾素α對Sp1活性的影響凝膠寡核苷酸探針(生物素標(biāo)記)序列如下:Sp1上游引物:5'-ATTCGATCGGGGCGGGGCGAGC-3';下游引物:5'-GCTCGCCCCGCCCCGATCGAT-3'。參照EMSA combo試劑盒說明進行操作，將細(xì)胞核蛋白抽提物(5μg)與生物素標(biāo)記的凝膠寡核苷酸探針(10 ng)在20℃條件下反應(yīng)30 min，反應(yīng)混合物經(jīng)6%非變性聚丙烯酰胺凝膠在0.5Tris-硼酸電泳緩沖液中電泳3 h(溫度4℃，電壓120V)。用半干電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移于尼龍膜上。用GEA封閉液室溫下封閉尼龍膜40 min后加入用緩沖液稀釋的堿性磷酸酶耦聯(lián)的鏈親和素，室溫震搖10 min，加化學(xué)發(fā)光底物后室溫孵育2 min，在暗室中曝光于X線膠片。

1.3.3 Western blotting法檢測 Sp1的表達及磷酸化程度 取20 mL總蛋白經(jīng)12% 十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，用 5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入Sp1一抗，4℃孵育過夜，次日用洗膜緩沖液TBST洗膜后加入熒光標(biāo)記的二抗(1∶10 000稀釋)，室溫孵育1 h。

2 結(jié) 果

2.1 干擾素α對Sp1活性的影響 干擾素α可明顯下調(diào)MHCC97H細(xì)胞中Sp1的活性，并呈劑量依賴性。見圖1。

2.2 干擾素α對Sp1蛋白含量和磷酸化水平的影響 干擾素α下調(diào)MHCC97H細(xì)胞中Sp1蛋白的表達及磷酸化水平，并呈劑量依賴性。見圖2。

圖1 干擾素α對MHCC97H細(xì)胞中Sp1活性的影響

圖2 干擾素α對MHCC97H細(xì)胞中Sp1蛋白表達及磷酸化水平的影響

3 討 論

肝癌根治術(shù)后5年的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率為60%～70%［2］。干擾素α能降低肝癌患者的術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率，提高患者的總生存率［4］，對其他腫瘤也有類似效果［8-9］，但干擾素降低腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的作用機制，目前尚不明了。

一般認(rèn)為，Sp1可能參與腫瘤發(fā)展、增殖和轉(zhuǎn)移。目前對Sp1的相關(guān)研究多集中在蛋白或基因水平。Yao等［5］發(fā)現(xiàn)，Sp1在胃癌細(xì)胞核內(nèi)呈高表達，在正常胃黏膜細(xì)胞呈低表達或無表達。Shi等［6］發(fā)現(xiàn)，胰腺癌中Sp1異?；罨?，可導(dǎo)致血管內(nèi)皮生成因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等下游基因過表達，增強腫瘤血管的生成效應(yīng)，從而促進腫瘤的侵襲和遠處轉(zhuǎn)移。

本研究采用EMSA法檢測干擾素α對Sp1活性的影響，結(jié)果顯示，干擾素α能明顯降低Sp1的活性，并呈劑量依賴性。此外，Sp1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性還受蛋白翻譯后修飾(如磷酸化、糖基化)等的調(diào)控［10-12］。本研究采用Western blotting法檢測干擾素α對Sp1蛋白表達和磷酸化水平的影響，結(jié)果顯示，干擾素α明顯下調(diào)Sp1在肝癌細(xì)胞MHCC97H細(xì)胞核內(nèi)的含量和磷酸化程度，并呈劑量依賴性，以Sp1蛋白磷酸化水平下調(diào)更為明顯。

研究［13］證實，干擾素抗肝癌的主要機制是抑制肝癌的血管生成，進而抑制肝癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移;而Sp1與VEGF啟動子特異性結(jié)合是VEGF轉(zhuǎn)錄調(diào)控最重要的機制［14］;本研究發(fā)現(xiàn)，干擾素可調(diào)節(jié)Sp1的活性、表達及磷酸化程度。由此判斷，Sp1可用于預(yù)測干擾素α抗肝癌的臨床療效。

［1］Siegel R，Ma J，Zou Z，et al.Cancer statistics，2014［J］.CA Cancer J Clin，2014，64(1):9-29.

［2］Tang ZY，Ye SL，Liu YK，et al.A decade's studies on metastasis of hepatocellular carcinoma［J］.J Cancer Res Clin Oncol，2004，130(4):187-196.

［3］Wang L，Tang ZY，Qin LX，et al.High-dose and long-term therapy with interferon-alfa inhibits tumor growth and recurrence in nude mice bearing human hepatocellular carcinoma xenografts with high metastatic potential［J］.Hepatology，2000，32(1):43-48.

［4］Sun HC，Tang ZY，Wang L，et al.Postoperative interferon alpha treatment postponed recurrence and improved overall survival in patients after curative resection of HBV-related hepatocellular carcinoma:a randomized clinical trial［J］.J Cancer Res Clin Oncol，2006，132(7):458-465.

［5］Yao JC，Wang L，Wei D，et al.Association between expression of transcription factor Sp1 and increased vascular endothelial growth factor expression，advanced stage，and poor survival in patients with resected gastric cancer［J］.Clin Cancer Res，2004，10(12 Pt 1):4109-4117.

［6］Shi Q，Le X，Peng Z，et al.Constitutive Sp1 activity is essential for differential constitutive expression of vascular endothelial growth factor in human pancreatic adenocarcinoma［J］.Cancer Res，2001，61(10):4143-4154.

［7］Wang L，Wei D，Huang S，et al.Transcription factor Sp1 expression is a significant predictor of survival in human gastric cancer［J］.Clin Cancer Res，2003，9(17):6371-6380.

［8 ］Zhu Y，Karakhanova S，Huang X，et al.Influence of interferon-α on the expression of the cancer stem cell markers in pancreatic carcinoma cells［J］.Exp Cell Res，2014，pii:S0014-4827.

［9］Pore N，Liu S，Shu HK，et al.Sp1 is involved in Akt-mediated induction of VEGF expression through an HIF-1-independent mechanism［J］.Mol Biol Cell，2004，15(11):4841-4853.

［10］Milanini-Mongiat J，Pouysségur J，Pagès G.Identification of two Sp1 phosphorylation sites for p42/p44 mitogen-activated protein kinases:their implication in vascular endothelial growth factor gene transcription［J］.J Biol Chem，2002，277(23):20631-20639.

［11］Onishi T，Yamakawa K，F(xiàn)ranco OE，et al.Mitogen-activated protein kinase pathway is involved in alpha6 integrin gene expression in androgen-independent prostate cancer cells:role of proximal Sp1 consensus sequence［J］.Biochim Biophys Acta，2001，1538(2-3):218-227.

［12］Wu J，Ling X，Pan D，et al.Molecular mechanism of inhibition of survivin transcription by the GC-rich sequence-selective DNA binding antitumour agent，hedamycin:evidence of survivin downregulation associated with drug sensitivity［J］.J Biol Chem，2005，280(10):9745-9751.

［13］Wang L，Wu WZ，Sun HC，et al.Mechanism of interferon alpha on inhibition of metastasis and angiogenesis of hepatocellular carcinoma after curative resection in nude mice［J］.J Gastrointest Surg，2003，7(5):587-594.

［14］潘奇，王魯，孫惠川，等.轉(zhuǎn)錄因子Sp1在肝癌細(xì)胞VEGF表達調(diào)控中的作用［J］.中國臨床醫(yī)學(xué)，2007，14(4):487-490.