李芳 孔凡志 李旭忠 周聯(lián)明 張光軍 黃忠明 何以豐 張學(xué)利

(1.蘇州大學(xué)研究生院，江蘇蘇州 215006;2.上海市奉賢區(qū)中心醫(yī)院普外科，上海 201400;3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海 200127)

化療是晚期胃癌的治療手段之一，然而，多藥耐藥常導(dǎo)致化療療效降低甚至失敗。為了克服化療耐藥的問題，抗腫瘤藥物常與其他治療方法(如熱療)聯(lián)合應(yīng)用。據(jù)報(bào)道，熱療在晚期癌癥患者中反應(yīng)良好，熱療可以增加腫瘤對(duì)放療和化療的敏感性，降低腫瘤細(xì)胞的耐藥性［1］。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于熱療影響化療敏感性的機(jī)制尚有爭(zhēng)議。本研究旨在從細(xì)胞水平上觀察熱療作用下胃癌細(xì)胞株對(duì)紫杉醇的敏感性變化。

1 資料與方法

1.1 細(xì)胞來源及試劑 胃癌細(xì)胞株MKN-45由復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)院遺傳開放實(shí)驗(yàn)室提供。DMEM/F12培養(yǎng)基購(gòu)自加拿大Wisent公司;胎牛血清、胰酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;CCK-8(cell counting kit-8)試劑盒購(gòu)自上海生博醫(yī)學(xué)生物工程科技公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司;RIPA裂解液Ⅰ購(gòu)自上海生工生物工程有限公司;多藥耐藥相關(guān)基因(multi-drug resistance gene，MDR1)及 β-actin 引物由美國(guó)Invitrogen公司合成。

1.2 主要儀器 聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增儀購(gòu)自浙江省杭州朗基科學(xué)儀器有限公司;酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Tek公司(型號(hào):ELx800);實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(real-time PCR，RT-PCR)儀購(gòu)自美國(guó) Applied Biosystems公司。

1.3 方法

1.3.1 引物的合成及 siRNA的設(shè)計(jì)和合成用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，β-actin上游引物為 5＇-GGCCTCGCTGTCCACCTTCC-3＇，下游引物為 5＇-TCACCTTCACCGTTCCAGTTTTTA-3＇，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為255 bp;MDR1基因上游引物為 5＇-TGCCATAGCTCGTGCCCTTGTTAG-3＇，下游引物為 5＇-TGCGTGCCATGCTCCTTGACTCT-3＇，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為 219 bp。

siRNA由上海吉瑪藥物有限公司設(shè)計(jì)并合成。針對(duì)MDR1基因選擇3個(gè)靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)3條siRNAs，序列如下:Si-1上游引物為 5＇-CACCCAGGCAAUGAUGUAUTT-3 ＇，下游引物為5＇-AUACAUCAUUGCCUGGGUGTT-3 ＇;Si-2 上游引物為 5＇-GCGAAGCAGUGGUUCAGGUTT-3 ＇，下游引物為 5＇-ACCUGAACCACUGCUUCGCTT-3＇;Si-3上游引物為5＇-CUUUGGCUGCCAUCAUCCATT-3 ＇，下游引物為 5＇-UGGAUGAUGGCAGCCAAAGTT-3 ＇，實(shí)驗(yàn)中用作siRNA的陰性對(duì)照命名為 siRNA-nc，陽(yáng)性對(duì)照為siRNA-β-actin。

1.3.2 胃癌細(xì)胞株的培養(yǎng)及siRNA轉(zhuǎn)染 對(duì)紫杉醇敏感的胃癌細(xì)胞株MKN-45用含10% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素、100 μg/mL兩性霉素的 DMEM/F12培養(yǎng)基，在37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的溫箱中培養(yǎng)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MKN-45細(xì)胞接種至含紫杉醇的完全培養(yǎng)液中，紫杉醇濃度為10 μg/mL，作用48 h后棄去含藥培養(yǎng)液，加入新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，待恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài)時(shí)消化傳代，再用10 μg/mL紫杉醇處理48 h，如此反復(fù)換液、傳代，逐步提高紫杉醇濃度，間歇誘導(dǎo)，最終獲得1株能耐受 300 μg/mL紫杉醇的細(xì)胞系，并將其維持培養(yǎng)在含0.1 μg/mL紫杉醇的完全培養(yǎng)液中，培養(yǎng)8個(gè)月后建立紫杉醇耐藥細(xì)胞株，命名為MKN-45/TAX。將細(xì)胞加入6孔板，細(xì)胞濃度為2×106個(gè)/mL，將細(xì)胞分為2組:轉(zhuǎn)染siRNA-MDR1的MKN-45/TAX組，轉(zhuǎn)染 siRNA-MDR1的 MKN-45組，在 37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下孵育。按siRNA說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作，以正常未作處理的MKN-45/TAX及MKN-45細(xì)胞作為對(duì)照。培養(yǎng)48 h后收獲細(xì)胞并進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.3 MDR1 mRNA水平的檢測(cè) 采用 RT-PCR法。用Trizol試劑提取細(xì)胞的總RNA，將總RNA反轉(zhuǎn)錄成 cDNA。RT-PCR反應(yīng)體系:Primer11 μL、Primer21 μL、cDNA 1 μL、Mg2+3 μL、10 × Buffer 3 μL、dNTP 1 μL、Taq 酶0.5 μL、無菌水 19.5 μL。在PCR擴(kuò)增儀中反應(yīng)，條件為:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，50℃退火45 s，72℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)。以β-actin管家基因作為內(nèi)參。在PCR產(chǎn)物中加入6 μL 6 × Loading Buffer混勻后，各取 10μL混合物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，并在凝膠成像系統(tǒng)中觀察。

1.3.4 P 糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)檢測(cè) 采用蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)法。實(shí)驗(yàn)分4組，分別為37℃ 1 h培養(yǎng)細(xì)胞、42℃ 1 h培養(yǎng)細(xì)胞、42℃1 h+siRNA-MDR1培養(yǎng)細(xì)胞和42℃ 1 h+siRNA-βactin培養(yǎng)細(xì)胞;每組分別有 MKN-45及 MKN-45/TAX兩種細(xì)胞。取各組細(xì)胞1×107個(gè)，按RIPA裂解液Ⅰ試劑說明書提取蛋白質(zhì)，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量，與等體積的2×SDS上樣緩沖液混合后，每泳道蛋白上樣量為20 μL，進(jìn)行十二烷基磺酸鈉–聚丙烯酰胺凝膠電泳(8%分離膠，4%濃縮膠)，然后電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加MDR1單克隆抗體(工作濃度為1∶100)和β-actin單克隆抗體(工作濃度為1∶1000)后4℃孵育過夜，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(工作濃度為1∶5000)后室溫溫育2 h，電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，曝光，顯影。

1.3.5 免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)細(xì)胞中MDR1的表達(dá) 取5×103個(gè)細(xì)胞，接種至24孔板中，37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的溫箱中培養(yǎng)48 h，然后磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3遍;用70%乙醇固定15 min，PBS洗3遍;加MDR1單克隆抗體后于4℃孵育1 h，PBS洗5 min，重復(fù)3次;加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育1 h，PBS洗5 min，重復(fù)3次;二氨基聯(lián)苯胺(3，3'-diaminobenzidine，DAB)顯色 10 min;自來水充分沖洗后，蘇木素復(fù)染，顯微鏡下觀察。

1.3.6 CCK-8法檢測(cè)不同溫度下siRNA干擾前后的MKN-45/TAX與MKN-45細(xì)胞在化療藥物環(huán)境中的活力

將siRNA干擾前后的胃癌細(xì)胞株MKN-45/TAX與MKN-45分別接種至96孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)為1×104個(gè)，培養(yǎng)2 d后每組各選18個(gè)孔，加入0.1、0.25、0.5 mg/mL 紫杉醇，在所有孔中加入 100 μL培養(yǎng)基;以不加化療藥物而種有細(xì)胞的18孔為對(duì)照組，再設(shè)3個(gè)只加100 μL培養(yǎng)基的空白對(duì)照組(不含細(xì)胞和化療藥物)。一塊板于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，另一塊板于42℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h。每孔加入10 μL的CCK-8試劑孵育4 h后，放入酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀中，于波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定吸光度值。將各組細(xì)胞與對(duì)照組進(jìn)行比較，計(jì)算各組細(xì)胞增殖抑制率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以表示，采用t檢驗(yàn)比較各組間差異，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CCK-8法檢測(cè)不同溫度下和不同濃度紫杉醇處理后各組細(xì)胞增殖抑制率 與37℃時(shí)相比，42℃時(shí)紫杉醇對(duì)MKN-45/TAX細(xì)胞的增殖抑制率明顯降低，對(duì)MKN-45的增殖抑制率明顯升高，見圖1。這說明升高溫度可提高M(jìn)KN-45細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性，而顯著降低MKN-45/TAX對(duì)紫杉醇的敏感性，高溫培養(yǎng)對(duì)兩者的作用正好相反。

圖1 不同溫度下紫杉醇對(duì)胃癌細(xì)胞株的增殖抑制率

2.2 Western blotting檢測(cè)各組細(xì)胞P-gp表達(dá)的變化 37℃時(shí)MKN-45細(xì)胞中P-gp表達(dá)水平低于MKN-45/TAX細(xì)胞;2種細(xì)胞經(jīng)42℃培養(yǎng)1 h后，細(xì)胞內(nèi)P-gp的表達(dá)量都較升溫前顯著增加，且MKN-45/TAX細(xì)胞中P-gp的表達(dá)升高幅度更大。見圖2。MDR1的高表達(dá)可能是MKN-45/TAX細(xì)胞株在高溫培養(yǎng)下出現(xiàn)反常行為的主要原因。

2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)各組細(xì)胞中P-gp的表達(dá) MKN-45/TAX細(xì)胞胞漿染色明顯比MKN-45細(xì)胞深，表明前者的P-gp基礎(chǔ)表達(dá)量高于后者，見圖3。42℃培養(yǎng)后2種細(xì)胞內(nèi)P-gp的表達(dá)量都較升溫前顯著增加，且MKN-45/TAX細(xì)胞中P-gp的表達(dá)量升高幅度更大，這與Western blotting檢測(cè)結(jié)果一致。

2.4 MDR1特異性siRNA可下調(diào)MKN-45/TAX細(xì)胞中 MDR1的表達(dá) 與對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染靶向MDR1的3條 siRNAs后48 h時(shí)，MKN-45細(xì)胞和MKN-45/TAX細(xì)胞中MDR1 mRNA的表達(dá)均下調(diào)，其中MDR1 siRNA-2干擾效果最佳，見圖4。因此，我們采用siRNA-2進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染MDR1的siRNA-2后，各組細(xì)胞P-gp蛋白的表達(dá)量較相應(yīng)的對(duì)照細(xì)胞明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖5。

圖2 Western blotting檢測(cè)不同溫度時(shí)胃癌細(xì)胞株中P-gp蛋白的表達(dá)

圖3 免疫組化檢測(cè)胃癌細(xì)胞株P(guān)-gp表達(dá)

2.5 轉(zhuǎn)染siRNA-2后高溫對(duì)各組細(xì)胞增殖抑制率的影響 將siRNA-2干擾后的兩組細(xì)胞株經(jīng)42℃培養(yǎng)并用CCK-8法檢測(cè)紫杉醇對(duì)其的增殖抑制率，siRNA-2干擾后2種細(xì)胞株對(duì)紫杉醇的敏感性均增加，并趨于一致。見圖6。

圖4 MDR1 mRNA的表達(dá)水平

圖5 Western blotting檢測(cè)MDR1 siRNA沉默前后胃癌細(xì)胞株中P-gp蛋白的表達(dá)水平

圖6 高溫時(shí)siRNA-2干擾后MKN-45及MKN-45/TAX對(duì)紫杉醇的敏感性的變化

3 討 論

熱療對(duì)細(xì)胞的殺傷作用主要取決于熱療的溫度及時(shí)間。研究［2］表明，胃癌細(xì)胞在40～43℃時(shí)凋亡最明顯，但該研究是在對(duì)化療藥物敏感的細(xì)胞和病例中進(jìn)行的，目前缺乏對(duì)已發(fā)生化療耐藥的細(xì)胞和病例的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，且國(guó)內(nèi)外關(guān)于熱療影響化療敏感性的機(jī)制尚存爭(zhēng)議［3-4］。為此，本實(shí)驗(yàn)篩選了對(duì)紫杉醇耐藥的MKN-45/TAX胃癌細(xì)胞，并就熱療對(duì)化療的增敏效果進(jìn)行了研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，P-gp在MKN-45及MKN-45/TAX中均有表達(dá)，但MKN-45/TAX中P-gp表達(dá)量較高。升溫處理后，P-gp在MKN-45及MKN-45/TAX中表達(dá)均增加，說明升溫促進(jìn)了P-gp表達(dá)。但是，升溫雖然增加MKN-45對(duì)紫杉醇的敏感性，但卻增加了MKN-45/TAX對(duì)紫杉醇的耐藥性。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，升溫培養(yǎng)后，P-gp表達(dá)量在MKN-45/TAX中上升幅度顯著高于MKN-45。由此可以推測(cè)，升溫致耐藥細(xì)胞更耐藥的原因與MDR1高表達(dá)有關(guān)。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，本研究引入了特異性 siRNA，使細(xì)胞中MDR1基因沉默，然后對(duì)2種細(xì)胞進(jìn)行升溫處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，升溫后2種細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性趨于一致，這說明P-gp高表達(dá)是MKN-45/TAX細(xì)胞在高溫培養(yǎng)下出現(xiàn)反常行為的主要原因，因此，對(duì)于耐藥細(xì)胞的這種反常行為來說，實(shí)施MDR-1干擾是一種有效的逆轉(zhuǎn)手段。

熱療能否逆轉(zhuǎn)多藥耐藥，令人關(guān)注，以往研究［5］表明，熱療聯(lián)合化療可降低腫瘤細(xì)胞耐藥性，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。其機(jī)制主要有以下幾方面:(1)輕度高溫可破壞細(xì)胞骨架成分，改變細(xì)胞膜的通透性，并抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)［4］;(2)高溫可增加藥物與DNA的交聯(lián)，降低DNA的修復(fù)能力，還可使某些蛋白質(zhì)變性，因此可能會(huì)逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的多藥耐藥;(3)高溫減少細(xì)胞新陳代謝，使藥物轉(zhuǎn)運(yùn)活化，提高細(xì)胞的藥物濃度，同時(shí)能降低癌中組織間隙液壓，增加癌組織對(duì)抗癌藥物的滲透性，直接滲透深度可達(dá)5 mm［6］;(4)富氧細(xì)胞對(duì)化療的敏感性高于乏氧細(xì)胞，乏氧細(xì)胞對(duì)熱療的敏感性高于富氧細(xì)胞，化療配合熱療可既殺滅富氧細(xì)胞，又殺滅乏氧細(xì)胞。然而，本研究發(fā)現(xiàn)，高溫可上調(diào)耐藥細(xì)胞中MDR1基因的表達(dá)量，加強(qiáng)其耐藥性。

本研究結(jié)果證明，升溫不一定增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，相反，在某些條件下，如細(xì)胞耐藥情況下，熱療還進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐受能力。

［1］張峰，劉國(guó)平，劉暢，等.進(jìn)展期胃癌患者術(shù)后腹腔持續(xù)溫?zé)峁嘧⒒熉?lián)合靜脈化療的療效觀察［J］.中國(guó)臨床醫(yī)學(xué)，2011，18(3):338-340.

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