何樺　趙祝香　張穎

【摘要】 目的：觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植在肺氣腫大鼠模型肺組織內(nèi)的定植情況。方法：選擇健康SD大鼠34只，按隨機(jī)數(shù)字表法分為MSCs干預(yù)組（A組，10只，慢阻肺大鼠，尾靜脈輸注MSC 1×106個(gè)/mL），肺氣腫模型組（B組，10只，慢阻肺大鼠，尾靜脈輸注等體積PBS）及MSC對(duì)照組（C組，10只，正常大鼠，尾靜脈輸注MSCs 1×106個(gè)/mL），正常對(duì)照組（D組，4只，正常大鼠，尾靜脈輸注等體積PBS），采用煙熏法復(fù)制大鼠肺氣腫模型。全骨髓培養(yǎng)法體外培養(yǎng)擴(kuò)增雄性SD大鼠來(lái)源的MSCs，經(jīng)GFP標(biāo)記細(xì)胞后將其經(jīng)尾靜脈注入肺氣腫模型SD大鼠體內(nèi)，24 h內(nèi)處死大鼠，取肺組織迅速冰凍切片，共聚焦激光顯微鏡下觀察觀察轉(zhuǎn)染GPF的間充質(zhì)干細(xì)胞在大鼠肺內(nèi)定植情況。結(jié)果：成功培養(yǎng)具有分化潛能的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，MSCs傳至第4代時(shí)有99.5%表達(dá)CD44、99.6%表達(dá)CD29等間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志，僅有0.4%表達(dá)CD34、1.0%表達(dá)CD45單核細(xì)胞以及造血干細(xì)胞表型；成功復(fù)制大鼠肺氣腫模型，香煙煙霧暴露組（A、B組）平均肺泡間隔為（119.0±26.2）μm，高于對(duì)照組（C、D組）的（89.8±17.3）μm，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；平均肺泡數(shù)為（173.9±68.3）個(gè)/mm2低于對(duì)照組的（280.3±104.0）個(gè)/mm2，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；顯微共聚焦發(fā)現(xiàn)MSCs經(jīng)尾靜脈注入大鼠體內(nèi)24 h后可見(jiàn)A組大鼠肺組織內(nèi)轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白質(zhì)粒的MSCs，而B(niǎo)組、C組及D組均未見(jiàn)轉(zhuǎn)染熒光。結(jié)論：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)尾靜脈輸注入后可在肺氣腫模型大鼠肺內(nèi)定植，為MSCs治療慢阻肺可能提供理論依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞； 肺氣腫； 移植

慢性阻塞性肺疾病（慢阻肺，COPD）嚴(yán)重影響人類健康，與慢性支氣管炎及阻塞性肺氣腫密切相關(guān)，而阻塞性肺氣腫可出現(xiàn)肺泡、支氣管上皮細(xì)胞的損傷，造成肺實(shí)質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞，且隨著病情進(jìn)展，肺功能進(jìn)行性下降?，F(xiàn)行的內(nèi)科治療手段是盡早去除致病因素，最大限度減少損傷細(xì)胞的數(shù)量及損傷程度，但往往無(wú)滿意的療效。肺移植是目前終末期間質(zhì)性肺疾病、慢阻肺患者唯一有效的治療方法，但由于存在供體數(shù)量的下降、免疫排斥反應(yīng)等問(wèn)題而限制了其應(yīng)用。目前人民迫切尋求一種新的、組織替代療法來(lái)治療這類不可逆的肺部疾病。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）由于來(lái)源方便、分離簡(jiǎn)單、擴(kuò)增迅速，可以取材于患者本人，傳代擴(kuò)增并定向誘導(dǎo)為特異細(xì)胞后，回輸給患者本人，安全性高，免疫原性低，且具有多向分化潛能引起廣泛的關(guān)注，被認(rèn)為是細(xì)胞移植和組織工程的種子細(xì)胞[1-3]。本實(shí)驗(yàn)將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）經(jīng)尾靜脈注入肺氣腫大鼠體內(nèi)，觀察MSCs植入大鼠體內(nèi)后在肺組織中的存活，為MSCs治療慢阻肺提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 大鼠MSCs的體外分離與鑒定 （1）MSCs的分離與培養(yǎng)：無(wú)菌條件下取出大鼠雙側(cè)股骨和脛骨，無(wú)菌PBS沖洗骨髓腔獲取骨單細(xì)胞懸液，將單細(xì)胞懸液1000 r/min，離心5 min，10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液5 mL重懸細(xì)胞，接種于培養(yǎng)瓶37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培，每3天換液一次。倒置相差顯微鏡逐日觀察并記錄的形態(tài)及生長(zhǎng)情況，當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)90%時(shí)，按1∶3比例傳代培養(yǎng)。取第4代MSCs進(jìn)行鑒定。（2）流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞CD表型：取第3代MSCs，生長(zhǎng)至90%融合時(shí)PBS洗滌2次，1×106的MSCs重懸于含0.1 mL PBS的PE管中，各管加入CD34、CD45、CD44及CD29，加入抗兔FITC，室溫孵育40 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)上述細(xì)胞表型，陰性對(duì)照為未加熒光抗體的MSCs細(xì)胞懸液。

1.2 移植MSCs的培養(yǎng)、標(biāo)記 取6孔培養(yǎng)板，向每孔中加入2 mL含（1～2）×105個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)液，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)至40%～50%匯合時(shí)轉(zhuǎn)染（匯合過(guò)度，不利于轉(zhuǎn)染細(xì)胞）。PBS洗細(xì)胞，10% FBS的DMEM/F12繼續(xù)培養(yǎng)，72 h后熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞的綠色熒光，棄病毒混合培養(yǎng)液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染后攜帶GFP的MSCs（GFP-MSCs）按1：3傳代培養(yǎng)，取第4代MSCs進(jìn)行鑒定。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及大鼠肺氣腫模型建立 SD大鼠34只按隨機(jī)數(shù)字表分為四組，MSCs干預(yù)組（A組，10只，慢阻肺大鼠，尾靜脈輸注MSCs 1×106個(gè)/mL），肺氣腫模型組（B組，10只，慢阻肺大鼠，尾靜脈輸注等體積PBS）及MSCs對(duì)照組（C組，10只，正常大鼠，尾靜脈輸注MSCs 1×106個(gè)/mL），正常對(duì)照組（D組，4只，正常大鼠，尾靜脈輸注等體積PBS）。采用煙熏法復(fù)制大鼠肺氣腫模型。將A、B組大鼠置于煙室內(nèi)，采用靜式吸入染毒方法，10支椰樹(shù)牌香煙置于吸煙孔內(nèi)，點(diǎn)燃香煙，每支香煙每分鐘吸一次，35 mL/次，收集主流煙氣和側(cè)流煙氣，通過(guò)塑料軟管與熏煙箱相連，將煙霧導(dǎo)入熏煙箱。其間，每隔5秒將箱內(nèi)流風(fēng)機(jī)開(kāi)啟10 s，使箱內(nèi)氣體分布均勻。8 min香煙點(diǎn)燃完畢，關(guān)閉吸煙系統(tǒng)。動(dòng)物每次暴露45 min，45 min后取出動(dòng)物，清洗熏煙箱。2次/d，共12周。煙霧暴露時(shí)動(dòng)物可在箱內(nèi)自由取食飲水。按上述方法將MSCs干預(yù)組第3代的轉(zhuǎn)染GFP質(zhì)粒的間充質(zhì)干細(xì)胞（每只1×106個(gè)/mL）尾靜脈注入A組大鼠體內(nèi)，B組注入等體積PBS；C組在相同時(shí)間內(nèi)注入1×106個(gè)/mL骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞等，D組注入等體積PBS，注入后24 h內(nèi)處死大鼠，取肺組織迅速冰凍切片，共聚焦激光顯微鏡下觀察觀察轉(zhuǎn)染GPF的間充質(zhì)干細(xì)胞在大鼠肺內(nèi)定植情況。第3代的轉(zhuǎn)染GFP質(zhì)粒的間充質(zhì)干細(xì)胞（每只1×106）進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MSCs培養(yǎng)與鑒定 原代培養(yǎng)的MSCs第24小時(shí)即可見(jiàn)梭形細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，到第6天時(shí)有大量梭形細(xì)胞呈克隆生長(zhǎng)，第10天左右細(xì)胞可長(zhǎng)滿皿底。細(xì)胞長(zhǎng)滿后與成體MSCs相似，呈旋渦狀（圖1）。按1：3進(jìn)行傳代培養(yǎng)，細(xì)胞在體外培養(yǎng)可穩(wěn)定傳至48代，在第4代做流式細(xì)胞表型鑒定，符合目前公認(rèn)間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞表型標(biāo)志。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，分離細(xì)胞傳至第4代時(shí)有99.5%表達(dá)CD44、99.6%表達(dá)CD29等間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志，0.4%表達(dá)CD34、1.0%表達(dá)CD45單核細(xì)胞以及造血干細(xì)胞表型（圖2）。

圖1 MSCs的原代培養(yǎng)（×400）

注：原代培養(yǎng)的MSCs第10天左右細(xì)胞長(zhǎng)滿皿底后，成體MSCs相似，呈旋渦狀。

2.2 SD大鼠肺氣腫模型的建立 香煙煙霧暴露后A、B組大鼠小氣道上皮呈鋸齒狀增生增厚，上皮脫落，纖毛倒伏，氣管內(nèi)見(jiàn)大量炎性滲出物，管壁結(jié)締組織增生，可見(jiàn)炎性細(xì)胞，及淋巴小結(jié)。肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡壁斷裂，肺泡腔擴(kuò)大，部分融合成肺大皰（圖3A）。C、D對(duì)照組大鼠小氣道黏膜上皮完整，纖毛未見(jiàn)黏連脫落，管壁規(guī)整未見(jiàn)增厚，未見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，管腔內(nèi)未見(jiàn)炎性滲出物，肺泡腔未見(jiàn)病理性擴(kuò)大（圖3B）。

香煙煙霧暴露組（A、B組）平均肺泡間隔為（119.0±26.2）μm，高于對(duì)照組（C、D組）的（89.8±17.3）μm，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；平均肺泡數(shù)為（173.9±68.3）個(gè)/mm2低于對(duì)照組的（280.3±104.0）個(gè)/mm2，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1。

表1 大鼠肺組織病理學(xué)改變情況（x±s）

組別 支氣管數(shù)

（只） 平均肺泡間隔（μm） 肺泡數(shù)

（個(gè)/mm2）

對(duì)照組（n=14） 27 89.8±17.3 280.3±104.0

香煙組（n=20） 28 119.0±26.2 173.86±68.3

F值 - 3.8 4.7

P值 - <0.01 <0.01

2.3 各組轉(zhuǎn)染GPF綠色熒光蛋白的表達(dá) 取第8代培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞，調(diào)整合適的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)密度，細(xì)胞融合40%～5%時(shí)轉(zhuǎn)染GPF綠色熒光蛋白質(zhì)粒，24 h后觀察轉(zhuǎn)染效果，在轉(zhuǎn)染GPF綠色熒光蛋白質(zhì)粒后48～96 h表達(dá)效果最好，質(zhì)粒發(fā)光強(qiáng)度大、數(shù)量多，效率可達(dá)40%左右。微共聚焦發(fā)現(xiàn)MSCs經(jīng)尾靜脈注入大鼠體內(nèi)24 h后，A組大鼠肺組織內(nèi)可見(jiàn)攜帶MSCs的綠色熒光，而B(niǎo)組、C組及D組均未見(jiàn)轉(zhuǎn)染熒光（圖4）。

3 討論

慢阻肺是一種全球性患病率較高的疾病，40歲以上人群，慢阻肺患病率為8.2%[5]。其患病率之高十分驚人，死亡率高，目前居全球死亡原因的第4位，經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)重，已成為世界第5大負(fù)擔(dān)的疾病，由于慢阻肺的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，病理改變可引起氣道結(jié)構(gòu)重塑、肺泡結(jié)構(gòu)破壞及肺血管減少，依靠機(jī)體的自我再生能力無(wú)法達(dá)到完全的修復(fù)，導(dǎo)致病情進(jìn)行性進(jìn)展。目前慢阻肺的內(nèi)科治療以抗炎、擴(kuò)張支氣管、氧療、呼吸運(yùn)動(dòng)鍛煉及增強(qiáng)免疫力等來(lái)緩解患者癥狀及降低患者未來(lái)健康惡化的風(fēng)險(xiǎn)，其作用非常有限，外科肺減容術(shù)及經(jīng)纖支鏡肺減容術(shù)等治療目的在于緩解癥狀和改善生活質(zhì)量，二者均不能阻止病情的進(jìn)行性發(fā)展。因此，如能尋找到一種有效修復(fù)氣道及肺部組織結(jié)構(gòu)，從而恢復(fù)肺功能的方法，將在慢阻肺的治療上將具有里程碑式的意義。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一類具有自我更新和多向分化潛能的成體干細(xì)胞。在一定條件下它可分化為心肌細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞等多個(gè)胚層來(lái)源的細(xì)胞[6-8]。而且骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外易于分離、培養(yǎng)和擴(kuò)增，免疫原性低，使其在組織工程、細(xì)胞移植、基因治療等領(lǐng)域具有十分廣闊的應(yīng)用前景[1]。近年來(lái)許多研究表明，干細(xì)胞移植可能為某些肺部疾病的治療帶來(lái)新希望[9-13]。1995年P(guān)ereira等[14]從表達(dá)人小基因膠原酶I的轉(zhuǎn)基因鼠中分離獲得成年骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，體外擴(kuò)增、培養(yǎng)，再通過(guò)尾靜脈注射入受致死劑量照射的小鼠中，1～5個(gè)月后，發(fā)現(xiàn)肺實(shí)質(zhì)、骨、軟骨細(xì)胞中都含有膠原酶I陽(yáng)性的細(xì)胞，骨髓來(lái)源干細(xì)胞移植移植到博萊霉素肺纖維化小鼠體內(nèi)，可產(chǎn)生肺泡I型細(xì)胞，并使其肺纖維化程度得到改善。目前MSCs在肺部疾病治療研究主要集中于急性肺損傷與肺間質(zhì)纖維化，在慢阻肺中的研究較少，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是否在慢阻肺大鼠體內(nèi)定植、分化呢？本研究通過(guò)全骨髓貼壁法獲得了足夠數(shù)量和活力的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，培養(yǎng)的MSCs不表達(dá)CD34和CD45，表達(dá)CD29和CD44，在一定的誘導(dǎo)條件下可向脂肪細(xì)胞骨細(xì)胞及軟骨細(xì)胞分化，提示成功培養(yǎng)MSCs。應(yīng)用GFP標(biāo)記的MSCs可表達(dá)綠色熒光蛋白，可應(yīng)用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。筆者應(yīng)用香煙煙熏成功復(fù)制肺氣腫大鼠，觀察經(jīng)尾靜脈注入的MSCs在肺氣腫大鼠肺內(nèi)的生存。將轉(zhuǎn)染GFP質(zhì)粒的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)尾靜脈輸注入肺氣腫模型大鼠體內(nèi)，經(jīng)快速冰凍切片發(fā)現(xiàn)肺氣腫模型大鼠肺內(nèi)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定植，這與Kidds等[15]報(bào)道相一致，為MSCs治療慢阻肺提供理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

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（收稿日期：2014-05-20） （本文編輯：蔡元元）

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（收稿日期：2014-05-20） （本文編輯：蔡元元）