賀宏梅 ，靳陶然 ，李娜 ，趙哲 ，邴琪 ，李楠 ，胡靜

活檢骨骼肌對(duì)肌糖原累積病的診斷價(jià)值

賀宏梅a，靳陶然b，李娜a，趙哲a，邴琪a，李楠a，胡靜a

目的：總結(jié)肌糖原累積病（MGSD）臨床與活檢骨骼肌的病理特點(diǎn)。方法：回顧性分析16例MGSD患者的臨床和骨骼肌病理資料。結(jié)果：臨床表現(xiàn)包括肌力下降、運(yùn)動(dòng)不耐受、肌痛、肌張力減低等，可合并多系統(tǒng)受累；血肌酸激酶不同程度升高；肌電圖正?；虺始≡葱?神經(jīng)源性損害。活檢骨骼肌病理分析：典型病理表現(xiàn)為細(xì)胞漿內(nèi)散在不定形空泡和/或PAS染色空泡內(nèi)糖原流失或蓄積；2例酸性磷酸酶活性增加；1例磷酸化酶活性缺失；電鏡下可見大量糖原顆粒聚集，MGSDⅡA病患者可見雙膜自噬泡、髓樣小體、溶酶體聚集和糖原顆粒蓄積。結(jié)論：骨骼肌活檢對(duì)MGSD診斷與鑒別診斷具有重要價(jià)值；細(xì)胞漿內(nèi)糖原空泡、糖原蓄積是重要病理診斷依據(jù)，酸性磷酸酶、磷酸化酶特殊染色有助于分型診斷，指導(dǎo)致病基因測(cè)序；電鏡下溶酶體髓磷脂樣改變支持MGSDⅡA型診斷。

肌糖原累積??；骨骼肌活檢；組織化學(xué)染色；病理分析

糖原累積?。╣lycogen storage disease，GSD）是一組單基因遺傳代謝性疾病，基因突變導(dǎo)致其編碼的糖原轉(zhuǎn)化相關(guān)酶缺陷，代謝底物堆積、供能障礙繼而引發(fā)多器官受累，于1928年首次報(bào)道[1]，發(fā)病率1/20 000～1/43 000[2]，根據(jù)致病基因、缺陷酶的不同可分為13種亞型[3]，以骨骼肌損害為主的稱為肌糖原累積病（muscle glycogen storage disease，MGSD），包括Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅶ型，主要表現(xiàn)為進(jìn)行性加重的肌無力和運(yùn)動(dòng)不耐受、痛性肌痙攣、周期性橫紋肌溶解等癥狀。本研究回顧性分析16例MGSD患者的臨床、病理資料，討論骨骼肌活檢病理對(duì)MGSD診斷的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

在我院神經(jīng)肌病科遺傳標(biāo)本庫(kù)（2004年9月至2013年9月）中篩選MGSD患者16例。

1.2 方法

1.2.1 總結(jié)患者一般資料、臨床表現(xiàn)、肌酸激酶、電生理及病理結(jié)果。

1.2.2 活檢骨骼肌冰凍切片組織化學(xué)、酶學(xué)染色病理分析 ①標(biāo)本獲取及處理：根據(jù)臨床資料和肌電圖結(jié)果選取活檢部位，簽署知情同意書后行骨骼肌開放式活檢，標(biāo)本快速液氮冷凍用于光鏡分析。②光鏡分析：骨骼肌標(biāo)本7μm冰凍連續(xù)切片，蘇木精-伊紅 （hematoxylin-eosin，HE）、改良 Gomori三色（modified gomori trichrome，MGT）、還原型輔酶Ⅰ四氮唑還原酶、琥珀酸脫氫酶、單磷酸腺苷脫氨酶、細(xì)胞色素C氧化酶、酸性磷酸酶、肌磷酸化酶、腺苷三磷酸環(huán)化酶（pH=4.35，4.65，9.95）、高碘酸 Schiff反應(yīng)（periodic acid schiff，PAS）、油紅 O、蘇丹黑B染色，光鏡下分析。

1.2.3 活檢骨骼肌透射電鏡超微病理分析 活檢骨骼肌標(biāo)本1μm超薄切片，經(jīng)4%戊二醛固定、磷酸緩沖液沖洗，再經(jīng)1%鋨酸固定，再次磷酸緩沖液沖洗，丙酮梯度脫水。醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重電子染色，于透射電子顯微鏡下分析。

2 結(jié)果

2.1 臨床表現(xiàn)

16例MGSD患者中男13例，女3例；就診年齡為1.4～38歲，平均21歲；發(fā)病年齡為0.1～36歲，平均17歲；均表現(xiàn)為肌力下降；近端肌為著9例，肌力為Ⅲ－～Ⅳ＋級(jí)；遠(yuǎn)端肌為著1例，肌力為Ⅳ－級(jí)；遠(yuǎn)近端肌力均減弱6例，肌力為Ⅱ～Ⅴ－級(jí)；伴肌張力減低7例；伴運(yùn)動(dòng)不耐受3例；伴肌痛3例；伴呼吸系統(tǒng)受累1例（表1）。

2.2 輔助檢查

血肌酸激酶（creatine kinase，CK）升高9例，波動(dòng)于 144～2 886 U/L，平均1 070U/L。肝功能谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine transam inase，ALT） 升高 3 例，AST波動(dòng)于 56～640 U/L，平均 349 U/L；ALT波動(dòng)于60～640 U/L，平均309 U/L。肝臟彩超示脂肪肝2例。心臟超聲示左室收縮功能減低和室壁運(yùn)動(dòng)異常2例。心肌核素顯像示左室下壁灌注減低2例。肌電圖示肌源性異常10例，神經(jīng)源性異常1例（表1）。

2.3 活檢骨骼肌病理分析

2.3.1 組織化學(xué)、酶學(xué)染色病理分析 HE和MGT染色顯示，14例肌纖維細(xì)胞漿內(nèi)可見典型空泡，空泡大小不一、數(shù)目不等、形態(tài)不規(guī)則，2例未見典型空泡；2例MGSDⅡA型肌纖維細(xì)胞漿中空泡類似“肥皂泡”樣改變，HE染色空泡內(nèi)含嗜堿性顆粒樣物質(zhì)，MGT染色呈紫紅色；PAS染色顯示16例肌纖維細(xì)胞漿可見空泡（糖原流失）和粉紅色深染（糖原蓄積），樹脂包埋、半薄切片PAS/甲苯胺藍(lán)染色顯示空泡處糖原蓄積呈粉紅色深染；2例MGSDⅡA型細(xì)胞漿內(nèi)酸性磷酸酶活性增高呈紅染；1例MGSDⅤ型磷酸化酶活性缺失（表 2、圖 1）。

2.3.2 透射電鏡超微結(jié)構(gòu)病理分析 1例MGSDⅡA型肌原纖維間糖原顆粒蓄積、溶酶體聚集、呈雙膜自噬泡、髓樣小體，線粒體結(jié)構(gòu)異常、Z線和肌原纖維網(wǎng)結(jié)構(gòu)紊亂、缺如；8例MGSD僅見肌膜下或肌原纖維間糖原顆粒聚集，糖原聚集區(qū)域肌原纖維缺如，線粒體結(jié)構(gòu)紊亂（表2、圖2）。

3 討論

MGSD多呈常染色體隱性遺傳，其中Ⅱ型又稱為MGSDⅡA，由位于溶酶體內(nèi)的酸性麥芽糖酶缺陷所致，溶酶體與細(xì)胞自噬密切相關(guān)，其內(nèi)酸性麥芽糖酶缺陷可導(dǎo)致糖原降解受阻，在引發(fā)自噬的同時(shí)影響正常自噬過程的進(jìn)行[4]，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。Ⅲ、Ⅴ和Ⅶ型分別因糖原脫支酶、肌磷酸化酶、肌磷酸果糖激酶缺乏所致，三者均位于細(xì)胞漿，糖原代謝受阻、異常產(chǎn)物堆積是導(dǎo)致細(xì)胞死亡的主要原因。

MGSDⅡ型主要累及肌肉和心臟，重癥患者常并發(fā)呼吸功能衰竭。嬰兒型表現(xiàn)為典型的松軟兒綜合征，可伴有心臟肥厚、呼吸系統(tǒng)感染等，病例1、2與上述報(bào)道一致。MGSDⅢ型近端肌無力可與肝臟癥狀同時(shí)或先后出現(xiàn)，肝臟癥狀隨著年齡增長(zhǎng)而好轉(zhuǎn)，多于青春期后消失，也可僅于成年后表現(xiàn)為無力。MGSDⅤ、Ⅶ型僅累及肌肉，主要表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)不耐受、肌痛、肌痙攣。與Ⅶ型區(qū)別的是Ⅴ型表現(xiàn)為繼減活動(dòng)陽性，不合并高尿酸血癥和溶血性貧血。病例8符合上述表現(xiàn)。

表1 16例肌MGSD患者臨床資料

表2 16例MGSD患者病理資料

圖1 MGSD患者骨骼肌病理組織化學(xué)及酶學(xué)染色結(jié)果

圖2 MGSD患者骨骼肌病理透射電鏡檢查結(jié)果（×20 000）

血CK、電生理檢查在MGSD中無特異性。甲狀腺功能、C反應(yīng)蛋白、血沉、血乳酸檢查對(duì)除外代謝相關(guān)性肌病、炎性肌病、線粒體肌病具有重要輔助作用。

MGSD病理特征性改變?yōu)榇笮〔灰?、?shù)目不等、形態(tài)不規(guī)則的空泡樣結(jié)構(gòu)/粉紅色深染（糖原蓄積）。特異性酶化學(xué)染色可提示分型診斷[3,5]。病例1、2病理形態(tài)學(xué)呈空泡如“肥皂泡”樣，HE/MGT染色空泡內(nèi)可觀察到嗜堿性/紫紅色顆粒樣物質(zhì)；PAS染色呈空泡和粉紅色深染，酸性磷酸酶活性增高。符合典型的MGSDⅡA型病理表現(xiàn)。病例8病理形態(tài)學(xué)呈形狀不規(guī)則空泡，PAS染色呈空泡和粉紅色深染，樹脂包埋后PAS染色示空泡部位糖原蓄積呈粉紅色深染，肌磷酸化酶活性缺失，符合典型MGSDⅤ型病理改變。

基因4q35的突變可導(dǎo)致空泡病理像的出現(xiàn)[6]，以空泡為主要病理改變的肌病包括MGSD、脂質(zhì)沉積病、包涵體肌炎、伴鑲邊空泡的遠(yuǎn)端肌病[7]、遺傳性包涵體肌病等，但各種空泡病理上有所區(qū)別：MGSD空泡形狀多不規(guī)則，PAS染色可見空泡內(nèi)糖原聚集。脂質(zhì)沉積病空泡多呈類圓形或裂隙狀，油紅O染色可見空泡內(nèi)脂質(zhì)沉積。后三者表現(xiàn)為HE染色周邊呈嗜堿性，MGT染色鑲紫紅邊的邊緣空泡，剛果紅染色下可見空泡周邊呈紅色無結(jié)構(gòu)物質(zhì)沉積。此外，尚有多種肌病可伴有空泡出現(xiàn)，但多為繼發(fā)改變，以其它病理形態(tài)學(xué)改變作為主像，提示診斷分型。Danon病是一種酸性麥芽糖酶活性正常的溶酶體貯積癥，病理上主要表現(xiàn)為細(xì)胞漿內(nèi)有嗜堿性顆粒狀物質(zhì)沉積[8]，可偶見微小空泡，其PAS、酸性磷酸酶染色均呈陽性，易與MGSDⅡ型相混淆，免疫組化抗C5b-9陽性作為其特有表現(xiàn)，可有效鑒別[8]。

MGSD電鏡可見糖原顆粒聚集于肌膜下或肌原纖維間[3,9-11]，MGSDⅡA型特異性表現(xiàn)為雙膜自噬泡、髓樣小體和溶酶體聚集[9,10]。糖原顆粒聚集無特異性，也可見于其它骨骼肌肌病導(dǎo)致的肌纖維變性。雙膜自噬泡和自噬碎片可提示自噬受阻，大量自噬碎片說明預(yù)后不良，酶替代療法效果差[12]。因此電鏡具有輔助MGSD診斷的意義，對(duì)明確發(fā)病機(jī)制和預(yù)后，指導(dǎo)治療具有重要作用。

MGSD病理提示糖代謝異常所致異常產(chǎn)物堆積和供能障礙引發(fā)臨床癥狀。因此有效治療方案應(yīng)以改善糖類代謝、補(bǔ)充蛋白質(zhì)為主，酶替代療法是目前研究的熱點(diǎn)。肌細(xì)胞出現(xiàn)大量空泡可提示MGSD，如未出現(xiàn)空泡且其他表現(xiàn)不明顯可結(jié)合PAS染色綜合分析。有研究表明酸性磷酸酶染色陽性的球狀物質(zhì)沉積可成為缺乏典型空泡表現(xiàn)的GSDⅡ成人型的診斷標(biāo)志物[13]。

除MGSD外，同樣表現(xiàn)為松軟兒綜合征的疾病還包括先天性肌營(yíng)養(yǎng)不良、先天性肌病和脊髓性肌萎縮癥等。其中表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)不耐受、肌痛的包括線粒體肌病、脂質(zhì)沉積病、內(nèi)分泌肌病和炎性肌病等，表現(xiàn)為緩慢進(jìn)行性加重的四肢近端肌無力的包括進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良、脂質(zhì)沉積病和炎性肌病等。但各種肌病骨骼肌活檢病理各有其特征表現(xiàn)，可進(jìn)行有效鑒別。

通過對(duì)酸性麥芽糖酶、糖原脫支酶活性的測(cè)定可分別確診MGSDⅡ型和Ⅲ型[14]。分子生物學(xué)檢測(cè)是MGSD診斷的重要標(biāo)準(zhǔn)，病理診斷可提示部分致病基因測(cè)序方向（MGSDⅡ、MGSDⅤ），病理分型不明的MGSD可依據(jù)多系統(tǒng)受累癥狀體征，分析可能的致病基因進(jìn)行測(cè)序，或直接基因芯片、高通量測(cè)序完成最終診斷，進(jìn)一步遺傳咨詢、產(chǎn)前診斷。

MGSD臨床表現(xiàn)復(fù)雜，診斷困難，活檢骨骼肌病理分析對(duì)其診斷及鑒別診斷具有重要價(jià)值，值得臨床推廣。

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Diagnosis Value of Skeletal M uscle Biopsy for M uscle G lycogen Storage Disease

HE Hong-mei,JIN Tao-ran,LINa,ZHAO Zhe,BING Qi,LINan,HU Jing.Departments ofNeuromuscularDisease,The Third HospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang 050051,China

Objective:To summary the clinical and skeletal muscle biopsy pathological features of muscle glycogen storage disease.Methods:The clinical and pathological data of the 16 cases ofmuscle glycogen storage disease(MGSD)were retrospectively analyzed.Results:The clinicalmanifestations includemuscle weakness,exercise intolerance,myalgia,and muscle tonus reducing which may be accompanied by multitude systems involvement.Serum creatine kinase was increased at varying degrees.Electromyography showed normal or myogenic or neurogenic damage.Typical pathology manifestation was unshaped vacuoles in the cytoplasm of muscle fibers,glycogen washed away or accumulated in the vacuoles in PAS staining.The activities of acid phosphatasewere increased in two cases.The activity of phosphorylasewas absent in one case.Many glycogens were accumulated under electronmicroscope.MGSDⅡA patients showed doublemembrane autophagy gathered vacuoles,myeloid bodies,lysosomes gathered and glycogen granules.Conclusion:Skeletal muscle biopsy pathology analysisplaysan important roleon diagnosisand differentialdiagnosis.Glycogen vacuolesand accumulation in the cytoplasm ofmuscle fibers are important pathology diagnosis evidence.Special staining such as acid phosphatase and phosphorylase is helpful in classification diagnosis and guiding causative gene sequencing.Lysosomemyelin-like change supportsMGSDⅡA disease diagnosisunderelectronmicroscope.

muscle glycogen storage disease;skeletalmuscle biopsy;histochemicalstain;pathologicalanalysis

R741;R741.04;R746.9

A

DOI10.3870/sjsscj.2014.05.011

河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院 a.神經(jīng)肌肉病科b.干部病房 石家莊 050051

2014-04 -06

胡靜

Jinghu5510@163.com

（本文編輯：王晶）