孫運(yùn)良，吳紅玉，金 晶，滿曉華，李淑德△

（1.江蘇省贛榆縣人民醫(yī)院消化內(nèi)科 222100；2.第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院消化內(nèi)科，上海200433）

胰腺癌是消化系統(tǒng)惡性程度極高的腫瘤，吉西他濱（gemcitabine，GEM）作為目前用于治療中晚期胰腺癌的一線化療藥物，對(duì)于提高胰腺癌患者生存期方面，效果并不令人滿意，接受其單藥治療患者的中位生存期僅為6個(gè)月左右，1年生存率小于20%［1］。尋求安全有效的方法增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，以期增加GEM的療效，受到了學(xué)者極大的關(guān)注。近年來研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤內(nèi)酯醇（triptolide，TPL）是一種廣譜的抗腫瘤藥物，聯(lián)合其他化療藥物能夠發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤的作用［2－6］，但目前關(guān)于TPL聯(lián)合GEM是否具有協(xié)同抗胰腺癌作用尚少有文獻(xiàn)報(bào)道。本研究以TPL、GEM聯(lián)合作用于體外培養(yǎng)的胰腺癌細(xì)胞，觀察兩藥對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響，并檢測(cè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子3（signal transducer and activa－tor of transcription 3，STAT3）、半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶－3（caspase－3）蛋白表達(dá)的變化，分析兩藥聯(lián)合作用的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC－1購(gòu)自美國(guó)ATCC公司，于長(zhǎng)海醫(yī)院消化內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室保存。TPL購(gòu)自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司（純度大于或等于98.0%），用二甲亞砜（DMSO）配成1mg／mL的原液，磷酸緩沖液（PBS）稀釋后備用。GEM為美國(guó)禮來公司產(chǎn)品，PBS稀釋后備用。Annexin VFITC凋亡檢測(cè)試劑盒為晶美生物工程有限公司產(chǎn)品。兔抗人磷酸化STAT3（p－STAT3）單克隆抗體為美國(guó)Cell Signaling Technology公司產(chǎn)品，兔抗人caspase－3多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) PANC－1細(xì)胞在含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)液中含青霉素、鏈霉素各100U／mL。

1.2.2 細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測(cè)PANC－1細(xì)胞增殖 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PANC－1細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，將5×103／孔的細(xì)胞加入96孔板。待細(xì)胞貼壁后，更換為無血清的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行后續(xù)的分組實(shí)驗(yàn)，（1）TPL單藥組：分別加入終濃度為10、20、40、80ng／mL的 TPL；（2）GEM 單藥組：分別加入終濃度為0.01、0.10、1.00、10.00μg／mL的 GEM；（3）聯(lián)合用藥組：10、20、40、80ng／mL的 TPL分別聯(lián)合1μg／mL的GEM；（4）GEM 單藥聯(lián)合TPL用藥組：0.01、0.10、1.00、10.00μg／mL的 GEM 分別聯(lián)合40ng／mL的TPL；同時(shí)以PBS作為對(duì)照組。將各組細(xì)胞在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48h后，每孔加入20μL MTT溶液（5mg／mL）。繼續(xù)培養(yǎng)4h后吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150μL DMSO，置于搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀波長(zhǎng)570nm處測(cè)量各孔的吸光度（A）。細(xì)胞抑制率（%）＝［1－（實(shí)驗(yàn)孔A值／空白對(duì)照孔A值）］×100%。兩藥聯(lián)合后的交互作用采用金正均法計(jì)算q值進(jìn)行判斷［7］；q＝E（a＋b）／（Ea＋Eb－Ea×Eb），其中E（a＋b）為a、b兩藥合用時(shí)對(duì)細(xì)胞的抑制率，Ea與Eb分別為a、b兩藥單獨(dú)應(yīng)用時(shí)對(duì)細(xì)胞的抑制率。當(dāng)q值為0.85～1.15時(shí)，表明兩藥具有單純相加作用；當(dāng)q＞1.15，表明兩藥具有協(xié)同作用；當(dāng)q＜0.85，表明兩藥相互拮抗。

1.2.3 Hoechst33258染色觀察細(xì)胞凋亡 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞PANC－1細(xì)胞分別以5×105／孔接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁后，分別加入40ng／mL的TPL、1μg／mL的GEM單藥或TPL聯(lián)合GEM，同時(shí)以PBS作為對(duì)照。將各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24h后，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌細(xì)胞3次，用4%多聚甲醛溶液固定10min，PBS沖洗細(xì)胞3次，加入Hoechst33258室溫避光染色10min后于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)變化。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)PANC－1細(xì)胞凋亡 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞PANC－1細(xì)胞分別以每孔1×105接種于24孔板，待細(xì)胞貼壁后，分別加入40ng／mL的TPL、1μg／mL的GEM單藥或TPL聯(lián)合GEM，同時(shí)以PBS作為對(duì)照。繼續(xù)培養(yǎng)24h后收集各組細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡。具體步驟按Annexin V－FITC試劑盒的說明書進(jìn)行。

1.2.5 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測(cè)PANC－1細(xì)胞p－STAT3、caspase－3蛋白表達(dá) 將PANC－1細(xì)胞經(jīng)40ng／mL的TPL、1μg／mL的GEM單藥或TPL聯(lián)合GEM處理24h后，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，蛋白分析系統(tǒng)（Bio－Rad）測(cè)定蛋白濃度，20%聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE），電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜。室溫下用含5%脫脂奶粉的1×TBS封膜2h。分別加入p－STAT3、caspase－3抗體，4℃孵育過夜，洗膜后加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗，室溫孵育2h，ECL顯影。結(jié)果用凝膠圖像軟件分析系統(tǒng)對(duì)膠片掃描，與內(nèi)參照βactin進(jìn)行比較。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以s表示，采用t檢驗(yàn)與方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 TPL、GEM單藥以及聯(lián)合用藥對(duì)PANC－1細(xì)胞增殖的影響 經(jīng)不同濃度的TPL單藥作用48h后，PANC－1細(xì)胞的增殖受到明顯抑制，其細(xì)胞抑制率隨著TPL濃度的增加而增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；且聯(lián)合用藥組的細(xì)胞抑制率顯著高于TPL單藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1A。金氏公式計(jì)算結(jié)果顯示，10、20、40、80ng／mL的 TPL聯(lián)合1 μg／mL的 GEM 的q值分別為1.17、1.18、1.16、1.17。隨著濃度的增加，無論是GEM單藥還是GEM聯(lián)合TPL均可明顯抑制PANC－1細(xì)胞的增殖，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與GEM單藥組相比，聯(lián)合用藥組的細(xì)胞抑制率明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1B；金氏公式計(jì)算的結(jié)果顯示，40 ng／mL的 TPL聯(lián)合0.01、0.10、1.00、10.00μg／mL的 GEM的q值分別為1.16、1.16、1.18、1.17。

圖1 TPL、GEM單藥以及聯(lián)合用藥對(duì)PANC－1細(xì)胞增殖的影響

2.2 TPL、GEM單藥以及聯(lián)合用藥對(duì)PANC－1細(xì)胞凋亡形態(tài)的影響 Hoechst33258染色結(jié)果顯示，TPL、GEM單藥組及聯(lián)合用藥組的細(xì)胞均出現(xiàn)了典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變，熒光顯微鏡下可見細(xì)胞核濃聚深染、核碎裂和凋亡小體形成等典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，且聯(lián)合用藥組的凋亡細(xì)胞數(shù)較TPL、GEM單藥組明顯增加；而對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞核呈均勻彌散熒光，未見明顯凋亡染色細(xì)胞，見圖2。

圖2 TPL、GEM單藥以及聯(lián)合用藥對(duì)PANC－1細(xì)胞凋亡形態(tài)的影響（×200）

圖3 TPL、GEM單藥以及聯(lián)合用藥對(duì)PANC－1細(xì)胞凋亡率的影響

2.3 TPL、GEM單藥組以及聯(lián)合用藥組對(duì)PANC－1細(xì)胞凋亡率的影響 TPL、GEM單藥以及兩藥聯(lián)合作用24h后，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡的結(jié)果顯示（圖3），對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率為2.6%±0.5%，而TPL、GEM單藥組以及聯(lián)合用藥組的細(xì)胞凋亡率分別為10.5%±1.0%、14.7%±1.2%和21.1%±2.6%；與對(duì)照組相比，TPL、GEM單藥組以及聯(lián)合用藥組的細(xì)胞凋亡率均明顯增加（P＜0.05），且聯(lián)合用藥組的細(xì)胞凋亡率顯著高于TPL、GEM單藥組（P＜0.05）。

2.4 TPL、GEM單藥以及聯(lián)合用藥對(duì) PANC－1細(xì)胞p－STAT3、caspase－3蛋白表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果顯示，TPL單藥組以及聯(lián)合用藥組的p－STAT3蛋白表達(dá)均較對(duì)照組下降，且聯(lián)合用藥組下降更為明顯，而GEM單藥組的p－STAT3蛋白表達(dá)無明顯變化；與對(duì)照組相比，TPL、GEM單藥組以及聯(lián)合用藥組的caspase－3蛋白表達(dá)均明顯增加，且聯(lián)合用藥組較TPL、GEM單藥組更能促進(jìn)caspase－3蛋白表達(dá)，見圖4。

圖4 TPL、GEM單藥以及聯(lián)合用藥對(duì)PANC－1細(xì)胞p－STAT3、caspase－3表達(dá)的影響

3 討 論

TPL是我國(guó)臨床上應(yīng)用的各種雷公藤制劑的主要活性成分，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，除了具有顯著的抗炎、免疫抑制等多種藥理作用外，TPL還是一種多靶點(diǎn)的抗腫瘤天然藥物；不僅其單藥具有強(qiáng)大的抑瘤作用，聯(lián)合其他化療藥物還可以提高化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，使腫瘤細(xì)胞不容易產(chǎn)生耐藥性［2－6］。Pigneux等［4］研究發(fā)現(xiàn)，TPL聯(lián)合低劑量的阿糖胞苷或伊達(dá)比星即可明顯促進(jìn)急性白血病細(xì)胞的凋亡。Yang等［5］研究顯示，TPL與羥喜樹堿聯(lián)合具有較強(qiáng)的協(xié)同性，可明顯增強(qiáng)羥喜樹堿對(duì)胰腺癌細(xì)胞的增殖抑制及凋亡誘導(dǎo)作用。本研究結(jié)果顯示，不僅TPL單藥具有體外抗胰腺癌的作用，且聯(lián)合GEM后可協(xié)同抑制PANC－1細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Zhu等［6］研究也發(fā)現(xiàn)，TPL可顯著抑制對(duì)GEM具有抵抗作用的PANC－1細(xì)胞增殖并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，聯(lián)合順鉑可發(fā)揮協(xié)同抗胰腺癌的作用。

盡管已有大量研究證實(shí)，TPL聯(lián)合其他化療藥物能夠發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用，但其相關(guān)機(jī)制尚有待于進(jìn)一步明確。STAT3是STAT家族中的重要成員，在多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的作用下，其單體中的酪氨酸基團(tuán)可發(fā)生磷酸化形成同源或異源二聚體，進(jìn)入細(xì)胞核與特定的DNA序列結(jié)合后啟動(dòng)靶基因轉(zhuǎn)錄，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化及發(fā)育等多種生理過程。近年來的研究已證實(shí)，STAT3在胰腺癌、結(jié)腸癌、胃癌、乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞中呈異常激活，過度激活的STAT3具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡等作用［8－10］。采用小分子化學(xué)藥物或siRNA等分子生物學(xué)手段阻斷STAT3的表達(dá)，已成為目前腫瘤分子靶向治療的新思路。本研究結(jié)果顯示，TPL在抑制PANC－1細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的同時(shí)，p－STAT3表達(dá)下降，提示抑制STAT3活性是TPL抗胰腺癌的機(jī)制之一。目前已有多項(xiàng)研究表明，抑制STAT3通路不僅具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，還可增加GEM以及其他化療藥物的抗腫瘤作用［11－13］。本研究發(fā)現(xiàn)，TPL 具有抑制 p－STAT3表達(dá)的作用，且聯(lián)合GEM后，p－STAT3表達(dá)進(jìn)一步下降，表明抑制STAT3通路可能是兩藥發(fā)揮協(xié)同抗胰腺癌作用的機(jī)制。

caspase是一類半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶，通常以無活性的酶原形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，經(jīng)過系列反應(yīng)被激活后，可參與切割細(xì)胞內(nèi)多種底物，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，在細(xì)胞凋亡過程中起關(guān)鍵作用。caspase－3是caspase家族中最重要的凋亡執(zhí)行者之一，是細(xì)胞凋亡過程中的主要效應(yīng)因子。研究顯示，caspase－3是STAT3促腫瘤作用的重要下游分子；抑制STAT3通路可上調(diào)caspase－3表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的目的［14－15］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不僅TPL、GEM單藥具有促進(jìn)caspase－3表達(dá)的作用，且兩藥聯(lián)合后，caspase－3表達(dá)進(jìn)一步增加；提示TPL聯(lián)合GEM可通過抑制STAT3通路，促進(jìn)caspase－3表達(dá)，從而發(fā)揮協(xié)同抑制胰腺癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。

綜上所述，TPL不僅其單藥具有抗胰腺癌作用，且聯(lián)合GEM后可協(xié)同抑制胰腺癌PANC－1細(xì)胞增殖并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與抑制STAT3通路，促進(jìn)caspase－3表達(dá)有關(guān)。目前在臨床上應(yīng)用的雷公藤制品一般為雷公藤提取物的混合成分，人們對(duì)TPL單體的提取分離以及對(duì)其在藥理作用機(jī)制的深入研究，必將對(duì)未來在臨床上應(yīng)用TPL聯(lián)合GEM治療胰腺癌起到極大的推動(dòng)作用。

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