秦興發(fā)，張 華△，漆洪波，陳國(guó)慶，馬海霞

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院產(chǎn)科 400016；2.廣東省深圳市婦幼保健院婦產(chǎn)科 518000）

子癇前期是重要的妊娠期高血壓疾病之一，目前發(fā)病機(jī)制仍不明確。自噬是細(xì)胞在不利于自身生長(zhǎng)的環(huán)境下，自我吞噬細(xì)胞成分并將其消化成小分子物質(zhì)，最終供細(xì)胞在缺氧、感染等惡劣環(huán)境下生長(zhǎng)，介導(dǎo)細(xì)胞逃逸死亡［1］，但過度自噬可導(dǎo)致Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡［2］。最近有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，滋養(yǎng)細(xì)胞自噬在重度子癇前期發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著極為關(guān)鍵的作用［3］，本研究以滋養(yǎng)細(xì)胞株HTR－8／SVneo為研究對(duì)象，擬觀察缺氧誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞自噬的發(fā)生情況，并分析子癇前期胎盤組織中自噬分子的變化，為進(jìn)一步解釋子癇前期發(fā)病機(jī)制提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 滋養(yǎng)細(xì)胞株HTR－8／SVneo由重慶醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞與組織工作研究室提供。胎牛血清為杭州四季青有限公司產(chǎn)品，PI染料為江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，RPMI－1640為美國(guó)GIBIO公司生產(chǎn)，PCR引物由大連生工合成。SP免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒、DAB顯色試劑盒均購(gòu)自北京中山生物有限公司，LC3－Ⅱ兔抗人一抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。激光共聚焦顯微鏡為日本Olympus產(chǎn)品，PCR相關(guān)儀器為美國(guó)Bio－Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分組與缺氧培養(yǎng) 滋養(yǎng)細(xì)胞株HTR－8／SVneo采用含10%胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，使用0.25%胰酶進(jìn)行消化傳代。細(xì)胞分為3組：正常氧濃度組（20%O2、5%CO2、75%N2）；低氧濃度Ⅰ組（8%O2、5%CO2、87%N2）；低氧濃度Ⅱ組（2%O2、5%CO2、93%N2），培養(yǎng)48h。

1.2.2 激光共聚焦顯微鏡檢測(cè) 將滋養(yǎng)細(xì)胞株HTR－8／SV－neo接種于蓋玻片上置于6孔板中，制作細(xì)胞玻片，細(xì)胞分組同1.2.1，培養(yǎng)48h后收集細(xì)胞，后經(jīng)固定后加入磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋的兔抗人LC3－Ⅱ單克隆抗體（一抗1∶500），4℃冰箱孵育過夜，次日清洗后加入FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG（二抗1∶200），室溫避光孵育30min，用10g／mL吖啶橙染液和Rnase A室溫下染色細(xì)胞30min，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.3 Q－PCR檢測(cè)LC3－Ⅱ mRNA的表達(dá) 細(xì)胞培養(yǎng)48h后提取各組 HTR－8／SVneo細(xì)胞的總 RNA，按 RT試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，應(yīng)用Q－PCR技術(shù)檢測(cè)LC3－Ⅱ mRNA的表達(dá)情況。LC3－Ⅱ基因的引物序列：上游5′－CAG GAG ACG TTC GCG ATG AAA TTG TCA－3′；下游5′－TGA CAA TTT CAT CGC GGA CGT CTC CTG－3′。內(nèi)參β－actin引物序列：上游5′－ATG GAA GCT GCT GGA ATC CAT－3′；下游5′－CCT TGC TCA TAC GGT CAG CAA TAC－3′。反應(yīng)總體系20μL，運(yùn)用2－ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4 胎盤組織LC3－Ⅱ免疫組織化學(xué)染色 選擇30例重度子癇前期患者胎盤，年齡21～34歲，均于孕34～36周采取剖宮產(chǎn)術(shù)終止妊娠，另取30例社會(huì)因素行剖宮產(chǎn)術(shù)足月妊娠孕婦作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，年齡24～37歲；術(shù)中胎兒娩出后，即取胎盤組織用于石蠟包埋后切片，進(jìn)行常規(guī)HE染色與SP法免疫組化染色，其中PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，LC3－Ⅱ一抗?jié)舛葹?∶200，山羊抗兔二抗?jié)舛葹?∶300。結(jié)果評(píng)判采用Fromowitz綜合評(píng)分法，根據(jù)細(xì)胞質(zhì)黃色顆粒的量，每張切片在高倍鏡下隨機(jī)盲取5個(gè)視野，共計(jì)數(shù)1 000個(gè)滋養(yǎng)細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SAS9.1統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用表示，組間比較采用單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)結(jié)果 正常氧濃度組HTR－8／SVneo細(xì)胞在激光共聚焦顯微鏡下見細(xì)胞大小均勻，染色一致，均呈現(xiàn)綠色，而低氧濃度Ⅰ組則見27%細(xì)胞呈現(xiàn)出細(xì)胞質(zhì)紅色，部分細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見點(diǎn)狀紅色，而低氧濃度Ⅱ組可見79%細(xì)胞質(zhì)均呈現(xiàn)紅色，部分細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見大片點(diǎn)狀染色物質(zhì)，見圖1。

圖1 不同氧濃度處理48h后的HTR－8／SVneo細(xì)胞（激光共聚焦×300）

2.2 PCR結(jié)果 低氧濃度組HTR－8／SVneo細(xì)胞經(jīng)處理48h后，細(xì)胞內(nèi)LC3－Ⅱ mRNA表達(dá)量明顯上升，均高于正常氧濃度組，其中低氧濃度Ⅱ組細(xì)胞的LC3－ⅡmRNA低于低氧濃度Ⅰ組，差異有無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 3組HTR－8／SVneo細(xì)胞經(jīng)處理48h后LC3－ⅡmRNA相對(duì)表達(dá)量

圖3 正常胎盤與重度子癇前期滋養(yǎng)細(xì)胞Beclin－1、LC3－Ⅱ免疫組織化學(xué)染色

2.3 免疫組織化學(xué)結(jié)果 LC3－Ⅱ蛋白在實(shí)驗(yàn)組胎盤組織中表達(dá)明顯，棕黃色顆粒遍布于兩種滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，部分呈黃色塊狀分布，而細(xì)胞核內(nèi)無表達(dá)（圖3），少部分正常滋養(yǎng)細(xì)胞胞質(zhì)中，偶見有淡黃色顆粒形成，實(shí)驗(yàn)組整體陽(yáng)性率為67.12%，而對(duì)照組整體陽(yáng)性率為9.14%，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討 論

作為妊娠期常見并發(fā)癥之一，子癇前期常造成孕產(chǎn)婦全身各細(xì)胞、組織、器官嚴(yán)重甚至不可逆轉(zhuǎn)的損傷，從而誘發(fā)心力衰竭、腎衰竭、全身多器官功能衰竭等嚴(yán)重的并發(fā)癥，臨床治療效果并不理想，常嚴(yán)重影響孕產(chǎn)婦和圍生兒的健康［4－6］。因此，預(yù)防和治療子癇前期是產(chǎn)科的重要任務(wù)之一，為制訂子癇前期更好的臨床防治策略，必須明確其發(fā)病機(jī)制。本病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，伴隨諸多基因及相應(yīng)蛋白表達(dá)變化，其明確的發(fā)病機(jī)理至今仍未完全闡明，目前對(duì)子癇前期發(fā)病機(jī)制的解釋主要集中在滋養(yǎng)細(xì)胞病變，但滋養(yǎng)細(xì)胞受到何種因素的影響，發(fā)生何種具體病變從而參與子癇前期發(fā)病，目前仍然值得深入研究。

自噬是最近發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞自我吞噬現(xiàn)象，研究表明，自噬現(xiàn)象與多種疾病均有密切關(guān)系，因而自噬已成為醫(yī)學(xué)科學(xué)與生命科學(xué)研究領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一［7］。在不利于細(xì)胞生長(zhǎng)的環(huán)境中，如缺氧、藥物影響，電離輻射等環(huán)境下，細(xì)胞能啟動(dòng)程序性自我吞噬，即表達(dá)大量自噬相關(guān)分子，在細(xì)胞內(nèi)形成自噬膜狀結(jié)構(gòu)，不斷的包圍細(xì)胞質(zhì)內(nèi)物質(zhì)，最終形成類圓形的雙層膜結(jié)構(gòu)體，即自噬體。自噬體與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)溶酶體結(jié)合，形成自噬性溶酶體，后者包括諸多消化酶，遂將自噬體所吞噬的自我物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)消化，將蛋白質(zhì)等生命大分子降解為小分子物質(zhì)，此類小分子物質(zhì)為細(xì)胞在緊急情況下提供內(nèi)源性直接生化反應(yīng)的底物，包括產(chǎn)生能量，合成新的生命分子，以使細(xì)胞在不利于生長(zhǎng)的環(huán)境中繼續(xù)保持生命［8］。然而，當(dāng)自噬程度過于嚴(yán)重，細(xì)胞自我吞噬的物質(zhì)過多或吞噬了細(xì)胞生長(zhǎng)關(guān)鍵分子時(shí)，將導(dǎo)致細(xì)胞死亡，因此自噬對(duì)細(xì)胞而言，具有雙重生物學(xué)作用，即適度自噬有利于細(xì)胞生長(zhǎng)，而過度自噬則可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

本研究表明，體外缺氧可誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生自噬，而重度子癇前期胎盤組織中，也可檢出明顯的自噬發(fā)生率。大量研究表明，子癇前期患者胎盤缺血缺氧嚴(yán)重，細(xì)胞常處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，而這種環(huán)境可促使自噬發(fā)生［9－10］。當(dāng)胎盤絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生過度自噬時(shí)，將導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞死亡。由于滋養(yǎng)細(xì)胞一半遺傳物質(zhì)來源于父系，因此細(xì)胞自噬所致的細(xì)胞裂解，將釋放出具有父源性物質(zhì)的部分，而這部分物質(zhì)作為抗原，可誘發(fā)母體免疫反應(yīng)，從而使母體血液淋巴細(xì)胞被激活，進(jìn)而攻擊滋養(yǎng)細(xì)胞，滋養(yǎng)細(xì)胞受損將導(dǎo)致胎盤著床過淺、微細(xì)梗死灶、小面積早剝點(diǎn)等。從而導(dǎo)致胎兒與母體營(yíng)養(yǎng)交換障礙，進(jìn)而導(dǎo)致子癇前期患者胎兒宮內(nèi)一系列發(fā)育問題。本研究應(yīng)用激光共聚焦檢測(cè)的方法，證實(shí)了經(jīng)缺氧處理后，滋養(yǎng)細(xì)胞可發(fā)生明顯的自噬，這也為自噬與子癇前期發(fā)病關(guān)系的研究奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

激光共聚焦顯微檢測(cè)是自噬研究的重要手段［10－11］，由于自噬體本身呈現(xiàn)酸性，與細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)其他亞細(xì)胞器的酸堿度不一致，因此在染料染色后所呈現(xiàn)的顏色也不同，而普通熒光顯微鏡波長(zhǎng)有限，不能很好地區(qū)分兩種不同顏色的物質(zhì)成分，因而也不能很好地將自噬體與亞細(xì)胞器等正常結(jié)構(gòu)區(qū)別開來，而激光共聚焦顯微檢測(cè)則很好地解決了這一問題。同時(shí)LC3是自噬的標(biāo)志物之一，其中LC3－Ⅰ是LC3的細(xì)胞質(zhì)形式，通過翻譯后修飾轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)C3－Ⅱ。而LC3－Ⅱ是自噬體膜構(gòu)成的關(guān)鍵蛋白［12－13］。本研究激光共聚焦顯微檢測(cè)結(jié)果與LC3－Ⅱ的PCR測(cè)試結(jié)果相符合。因此，激光共聚焦顯微檢測(cè)是自噬研究的重要形態(tài)學(xué)方法之一，隨著自噬研究的廣泛開展，激光共聚焦顯微檢測(cè)也必將得到進(jìn)一步發(fā)展及價(jià)值體現(xiàn)，將激光共聚焦顯微檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于子癇前期重度的發(fā)病機(jī)理和病理生理的應(yīng)用研究，有利于探索子癇前期重度的臨床診療效果。

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