李寧　譚珍媛　陳鐵寓等

[摘 要] 利用一維傅里葉變換紅外光譜法及二維紅外相關(guān)光譜法對難治性細菌性陰道病患者與正常婦女分泌物進行研究，探討其一維、二維紅外光譜特征及其差異，為快速診斷難治性細菌性陰道病提供依據(jù)。實驗結(jié)果表明，病患者分泌物的一維紅外光譜主要具有如下特征：與蛋白質(zhì)、核酸、肽聚糖相關(guān)紅外吸收峰的峰強比I3380/I1460和I1550/I1460，I1080/I1460，I1026/I1460明顯升高，表明分泌物中蛋白質(zhì)、核酸、殼聚糖的含量升高，而與脂類相關(guān)的I2925/I1460則低于正常值表明分泌物中脂類含量降低。此外，患者酰胺I帶波數(shù)明顯降低，顯示其蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)組成與正常人的有明顯差異；結(jié)合二階導(dǎo)數(shù)光譜和二維紅外光譜可以將患者與正常人的分泌物完全區(qū)分開來。初步研究表明，F(xiàn)T-IR有可能為快速診斷難治性細菌性陰道病提供一種新的方法和技術(shù)。

[關(guān)鍵詞] 難治性細菌性陰道病；診斷；傅里葉紅外，二維紅外

中圖分類號：R711.31 O657 文獻標識碼：A 文章編號：2095-5200（2014）05-001-04

[Abstract] The aim of the research was to establish the vaginal secretion basis for the recurrent BV by exploring a method to obtain 1D and 2D FT-IR spectrum of the secretion sample with FT-IR spectroscopy，and probing the characteristic features of recurrent BV compared with the normal ones. The results showed that the FT-IR spectrum of recurrent BV secretion was different from normal one： The ratio of I3380/I1460 and I1550/I1460，I1080/I1460，I1026/I1460 related to the protein，nuclear acid and chitosan were higher than in the normal one，which indicated their concentration increased in the secretion. The ratio of I2925/I1460 related to the lipid was lower than in the normal ones，which showed the relative quantity was less in the morbid secretion. Moreover，the amide band I of the patients obviously moved to lower wavenumber also indicated the secondary structure of related protein was different. Further research on the second derivative and 2D of FT-IR spectrum also unveiled great difference between the morbid and normal secretion. It can be concluded that FT-IR could be a potential method for rapid diagnosis of recurrent BV.

[Key words] recurrent BV；diagnosis；FT-IR；2D FT-IR

引言

細菌性陰道?。╞acterial vaginosis，BV）是陰道內(nèi)正常菌群失調(diào)所致的一種混合性感染，感染菌群有加德納菌、動彎桿菌、普雷沃菌、紫單胞菌、類桿菌等厭氧菌以及人型支原體[1]。難治性細菌性陰道病是指BV經(jīng)規(guī)范化治療3個療程癥狀未見明顯好轉(zhuǎn)或1年發(fā)作4次以上者[2]。傳統(tǒng)的難治性細菌性陰道病確診過程需結(jié)合細菌培養(yǎng)、臨床病歷和復(fù)發(fā)史等進行判斷，存在確診周期長、主觀性強的缺點[3]?；颊咄鶡o法及時獲得針對性治療，導(dǎo)致病情進一步惡化[4]，因此，急需建立一種快速而有效的診斷方法。

紅外光譜（Infrared Spectrometry，IR）具有快速，簡單可靠特點，可以在分子水平上反映組織和成分差異，已成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的熱門研究對象，近年來國內(nèi)外研究人員將其應(yīng)用在蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)測定[5-6]、惡性腫瘤的快速診斷[7-9]，并取得了一定成果，有望成為新的診斷技術(shù)?；诖?，本研究著眼于傅里葉紅外光譜法，通過分析細菌性陰道病患者與正常婦女分泌物在紅外光譜上存在的差異，探索其用于難治性細菌性陰道病診斷上的可行性。

1 實驗部分

1.1 標本取材和處理

陰道分泌物樣品均來自廣西南寧市婦女兒童醫(yī)院，經(jīng)菌群培養(yǎng)結(jié)合復(fù)發(fā)病史確診為難治性細菌性陰道病的患者和作為對照組的正常婦女各20例，接受取樣的對象均為年齡35-40歲的婦女。

樣品采集后，立即用酒精固定，真空干燥48h后按干重1：20混合KBr，每個樣品取200mg進行壓片并測定紅外光譜。

1.2 儀器和數(shù)據(jù)處理

（1） Perkin Elmer Spectrum100 傅里葉變換紅外光譜儀，光譜范圍4000～450 cm-1，分辨率2 cm-1，得到陽性組和對照組各樣品的光譜圖后，測量相應(yīng)的陽性組與對照組各峰強比，數(shù)據(jù)用SPSS19.0軟件進行t檢驗統(tǒng)計學(xué)分析，最后分別求出陽性和對照組平均光譜圖。

（2）二階導(dǎo)數(shù)光譜：導(dǎo)數(shù)光譜的獲得采用Perkin Elmer公司Specturm v6.3.1操作軟件，平滑點數(shù)為13，分析范圍：1350～850 cm-1。

（3）二維相關(guān)紅外光譜： Perkin Elmer熱擾組件，升溫范圍：60～85℃，升溫速率1℃/1min，每隔5℃測定一次紅外光譜圖。二維相關(guān)紅外光譜的獲得采用Perkin Elmer公司的Transform二維相關(guān)分析軟件以及Matlab 5.7分析軟件，分析范圍：1200～850 cm-1。

2 結(jié)果與分析

2.1 陽性組與對照組分泌物的一維紅外光譜分析比較

（1）與蛋白質(zhì)相關(guān)的譜帶：蛋白質(zhì)在紅外光譜區(qū)主要在3380cm-1，1650cm-1和1550cm-1處有吸收。其中3380cm-1附近的寬高峰由N-H單鍵的振動引起，此外蛋白質(zhì)上的O-H伸縮振動也在此有吸收。1650cm-1左右的尖吸收峰為蛋白質(zhì)的酰胺（CONH2）I帶，由酰胺的羰基伸縮振動引起。1550cm-1左右的吸收峰為蛋白質(zhì)的酰胺II帶，由C≡N伸縮以及C-H的彎曲振動引起。從表1可以看出，來自患者的樣品其紅外光譜的峰強比I3380/I1460以及I1550/I1460明顯升高，表明蛋白質(zhì)相對含量升高，其原因可能是患者的免疫系統(tǒng)受到病菌刺激，產(chǎn)生強烈的吞噬作用以及分泌各種蛋白酶。此外，患病組樣品1650cm-1左右酰胺I帶的吸收峰比對照組的向低波數(shù)移動了5 cm-1左右，酰胺I帶為多個氨基酸殘基重疊而成的峰，根據(jù)文獻報道，表明蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的構(gòu)成比例發(fā)生了變化，向低波數(shù)位移的幅度越大，β-折疊和β-轉(zhuǎn)角比例也越多，相應(yīng)的α-螺旋所占的比例越小[10-11]。

（2）與脂類相關(guān)的譜帶：圖譜上與脂類相關(guān)的峰主要是2926cm-1，2854cm-1，1460cm-1以及1384cm-1。從表1可以看出，在患者的分泌物樣品中，I2925/I1460比值與正常人相比明顯降低，這表明脂類物質(zhì)含量減少。由于脂類可為機體提供能量，機體受到感染時，免疫系統(tǒng)吞噬、呼吸爆發(fā)等活動加劇，新陳代謝的活動增加，這種情況下脂類物質(zhì)將很難累積。

（3）與磷酸相關(guān)譜帶：圖譜上與核酸類相關(guān)的峰主要是1238cm-1、1079cm-1，分別由P=O雙鍵的彎曲振動以及P-O單鍵的彎曲振動引起。從表1可以看出，患者分泌物I1080/I1460較正常分泌物有大幅度的升高，表明磷脂及核酸物質(zhì)在增加。在機體對抗病菌過程中，人體免疫細胞以及病菌都會大量消亡，細胞死亡后大量構(gòu)成細胞膜的磷脂物質(zhì)將被釋放出來。此外，被感染部位的免疫細胞以及細菌分裂都比正常的迅速，因此遺傳物質(zhì)的含量明顯增加。

（4）與糖類相關(guān)的譜帶：細菌具有細胞壁，主要成分是肽聚糖，這是細菌區(qū)別于人體細胞的重要標志，肽聚糖（peptidoglycan，其骨架是由N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸通過β-1，4糖苷鍵交替相聯(lián)而組成的線狀聚糖鏈）在指紋區(qū)1026 cm-1通常有比較明顯的吸收峰。細菌被破壞后，肽聚糖被釋放出來，容易在紅外圖譜上呈現(xiàn)吸收峰[12]。從表1看，患者分泌物I1026/I1460強度幾乎為正常人的3倍，從圖1上看，患者平均光譜1026 cm-1處的吸收峰尖銳而明顯，強度甚至大于1079cm-1處的核酸吸收峰，而形成鮮明對比的是對照組在此處的吸收幾乎被埋沒。

2.2 陽性組與對照組分泌物的二階導(dǎo)數(shù)譜分析比較

為了更直觀地表示出難治性細菌性陰道病患者與正常婦女分泌物在指紋區(qū)的差別，我們對二者的平均光譜進行二階取導(dǎo)，二階導(dǎo)數(shù)譜圖見圖2、圖3。在1350-850cm-1的光譜區(qū)域內(nèi)，陽性組與對照組分泌物有明顯區(qū)別，前者在1195 cm-1、1437 cm-1、1008 cm-1、948 cm-1處出峰，而后者分別位移至1190 cm-1、1435cm-1、1011 cm-1、950 cm-1處。此外前者還在868 cm-1處多出1個峰。在1350～1150cm-1的區(qū)域內(nèi)，患者的分泌物在1295 cm-1、1198 cm-1、1164 cm-1處有明顯的3個峰，而正常婦女分泌物在這一區(qū)域的二階導(dǎo)數(shù)譜沒有出峰，譜線接近平滑，通過二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜已經(jīng)能將二者初步鑒別，下面將使用二維紅外圖譜對二者進行深入鑒別。

2.3 陽性組與對照組分泌物的二維紅外光譜分析比較

難治性細菌性陰道病患者與正常婦女分泌物在850～1200cm-1范圍內(nèi)的二維相關(guān)紅外光譜見圖4、圖5。圖中左邊為二者的同步二維紅外平面相關(guān)譜，右邊為對應(yīng)的同步立體相關(guān)譜。可以看出，正常婦女分泌物在同步譜中的對角線位置出現(xiàn)5個自動峰，分別在850cm-1、875cm-1、970 cm-1、1000cm-1、1025cm-1處，其中1000cm-1、1025cm-1處的自動峰強度最大，而患者分泌物在850～1200cm-1區(qū)域?qū)蔷€僅850 cm-1、970cm-1處有較弱的自動峰。此位置主要為酰胺及其衍生物的C-N彎曲振動吸收區(qū)域。通過二維譜圖，說明患者分泌物中的酰胺C-N彎曲振動隨溫度升高的變化遠弱于正常分泌物。

3 結(jié)論

難治性細菌性陰道病的診斷一直是臨床醫(yī)學(xué)的難題之一。紅外光譜可以快速簡便地從分子水平檢測組織樣品，從物質(zhì)的組成和分子結(jié)構(gòu)方面提供依據(jù)，配合菌群培養(yǎng)診斷技術(shù)，可以彌補傳統(tǒng)檢測技術(shù)的不足。本課題研究采取臨床取樣后KBr壓片獲取紅外光譜的方法，對難治性細菌性陰道病患者與正常婦女分泌物的光譜特點進行了研究。二者在紅外光譜上有著較大不同，不論從物質(zhì)構(gòu)成、類型等方面均有較大差異，結(jié)合二階導(dǎo)數(shù)、二維紅外相關(guān)光譜更能直觀地體現(xiàn)患者分泌物與正常人的不同，紅外光譜的操作也很方便。初步研究結(jié)果表明，傅里葉變換紅外光譜分析可能成為一種診斷難治性細菌性陰道病的新方法。

參 考 文 獻

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