羅鵬等

【摘要】 目的：探討香煙暴露及戒煙對大鼠肺白介素-8、谷胱甘肽（GSH）及組蛋白去乙?；?（HDAC2）的影響。方法：健康雄性SD大鼠40只隨機(jī)分對照組、吸煙組（1月、2月組）、戒煙組（1月、2月組）。每組8只，吸煙組及戒煙組大鼠每天給予煙熏兩次，吸煙組煙熏1月、2月取材；戒煙組煙熏2月后再繼續(xù)飼養(yǎng)1月和2月后取材，分別檢測支氣管肺泡灌洗液（BALF）中白介素-8和GSH、肺組織HDAC2的表達(dá)。結(jié)果：比較吸煙組、戒煙組和對照組BALF中白介素-8含量升高、GSH濃度下降，戒煙后GSH漸升高，但仍不能達(dá)到正常；吸煙組肺組織HDAC2含量逐漸降低，戒煙后HDAC2又逐漸升高，但與對照組比較，仍有下降。結(jié)論：香煙暴露可誘導(dǎo)氣道氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致GSH減少，HDAC2減少，戒煙可有所改善。

【關(guān)鍵詞】 香煙； 白介素-8； 谷胱甘肽； 組蛋白去乙酰化酶2

【Abstract】 Objective： To evaluate the impacting of IL-8， GSH and HDAC2 in the lung of cigarette exposure and cessation rats. Method： 40 SD rats were randomly divided into control group， smoking group （January， February group）， smoking cessation group （January， February group）， smoking group were sacrificed at 1 month and 2 month， smoking cessation group was sacrificed when smoking cessation for 1 month and 2 months. To collect the cells in BALF and lung tissue， and detect the IL-8，GSH and HDAC2 in rats lung tissue. Result： Compared with control group， the levels of IL-8 in smoking group and smoking cessation group increased （P<0.01）， the levels of GSH and HDAC2 in smoking group and smoking cessation group decreased （P<0.01）， but smoking groups level was lower than that of smoking-cessation groups. Conclusion： It shows that cigarette exposure can induce airway oxidative stress. It can decrease after quitting， but still can't back to the normal.

【Key words】 Smoke； IL-8； GSH； HDAC2

First-authors address： Xili Peoples Hospital in Nanshan District of Shenzhen City， Shenzhen 518055， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.22.006

吸煙是導(dǎo)致慢性阻塞性肺疾?。–hronic obstructive pulmonary disease， COPD）的重要因素[1]。慢性氣道炎癥是COPD的典型特征，香煙煙霧通過激活吸煙者和COPD患者肺部的氧化應(yīng)激反應(yīng)觸發(fā)了氣道的慢性炎癥[2]。本文利用煙熏大鼠造成大鼠COPD模型，分析吸煙及戒煙后大鼠支氣管肺泡灌洗液中谷胱甘肽（Glutathione， GSH）及肺組織中組蛋白去乙?；?（histone deacetylase 2， HDAC2）的變化，進(jìn)一步探討吸煙導(dǎo)致COPD的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 GSH ELIASA試劑盒（美國RD公司），兔抗鼠HDAC2抗體及免疫組化SP試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 健康清潔級雄性大鼠40只（安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供），隨機(jī)分五組，對照組、吸煙1月組、吸煙2月組、戒煙1月組和戒煙2月組。

1.3 模型制備 紅三環(huán)牌過濾嘴香煙：焦油含量11 mg/支，煙氣一氧化碳量15 mg/支，煙堿量0.8 mg/支，由安徽中煙工業(yè)公司滁州卷煙廠出品。各實(shí)驗(yàn)組均在自制吸煙箱（80 cm×70 cm×50 cm）每天兩次，每次10支香煙持續(xù)煙熏半小時。戒煙組在煙熏兩個月后停止并繼續(xù)飼養(yǎng)1月及2月。

1.4 取材 大鼠腹腔注射10%的水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，開胸分離肺后結(jié)扎左主支氣管，右肺注入10 mL生理鹽水后抽取肺泡灌洗液，重復(fù)3次，回收液離心后留上清液于-70 ℃冰凍備檢。左肺組織送病理和免疫組化檢測。

1.5 指標(biāo)檢測 IL-8、GSH和HDAC2嚴(yán)格按照ELIASA試劑盒操作。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS 13.0軟件，不同組間差異性采用單因素方差分析，兩變量間的相關(guān)性分析用Pearson相關(guān)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理改變 實(shí)驗(yàn)組大鼠雙肺有不同程度氣腫及淤血。光鏡下：對照組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)正常連續(xù)；吸煙1月組肺泡結(jié)構(gòu)受損，可見支氣管黏膜上皮纖毛倒伏、粘連，肺泡內(nèi)見淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤；吸煙2月組損害加重，肺泡腔擴(kuò)大融合，彈力纖維層破壞，肺泡數(shù)量減少；戒煙組仍可見肺泡結(jié)構(gòu)受損、肺泡融合，淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤較吸煙組減少；戒煙2月組較1月組病理改變輕。endprint

2.2 支氣管肺泡灌洗液（BALF）IL-8的變化 對照組（39.85±8.83）pg/mL、吸煙1月組

（50.29±5.60）pg/mL、吸煙2月組（56.29±4.81）pg/mL，

戒煙1月組（54.31±6.43）pg/mL、戒煙2月組（51.35±7.47）pg/mL。吸煙組與戒煙組各組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.300）。對照組與吸煙組和戒煙組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.3 大鼠BALF中GSH的變化 對照組BALF中GSH含量（133.42±10.33）mg/L、吸煙1月組（125.42±9.54）mg/L、吸煙2月組（116.96±6.85）mg/L、戒煙1月組（120.51±8.58）mg/L、戒煙2月組（130.94±6.96）mg/L。對照組與吸煙組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；對照組與戒煙組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；吸煙組與戒煙組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

2.4 大鼠肺組織HDAC2的變化 HDAC2的累積光密度值（IOD）：對照組（0.87±0.03），吸煙1月組（0.78±0.02），吸煙2月組（0.73±0.01），戒煙1月組（0.75±0.01），戒煙2月組（0.76±0.04）。對照組與吸煙組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），其余兩兩組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

2.5 BALF 中IL-8、GSH與肺組織HDAC2蛋白相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析，大鼠支氣管肺泡灌洗液IL-8與GSH呈負(fù)相關(guān)（r=-0.63，P<0.05），大鼠肺組織HDAC2蛋白表達(dá)與支氣管肺泡灌洗液IL-8水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.59，P<0.05），與GSH水平呈正相關(guān)（r=0.43，P<0.05）。

3 討論

慢性阻塞性肺部疾?。–OPD）是一種常見的慢性炎癥性疾病，以進(jìn)行性發(fā)展的氣流受限不完全可逆為特征，與肺部對有害氣體或有害顆粒的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)[3]。吸煙可導(dǎo)致COPD，在COPD和吸煙者的肺部均可以觀察到由于氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)觸發(fā)的炎癥反應(yīng)[4]。目前研究認(rèn)為，香煙煙霧通過激活巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞釋放蛋白酶和活性氧等引起細(xì)胞損傷和氣道炎癥[4]。

IL-8是一種多功能細(xì)胞因子，通過激活、趨化中性粒細(xì)胞并在氣道內(nèi)聚集，導(dǎo)致細(xì)胞變形反應(yīng)和脫顆粒反應(yīng)、呼吸爆發(fā)反應(yīng)后釋放溶酶體和形成超氧化物，參與COPD的炎癥反應(yīng)[5]。研究顯示與健康吸煙者和不吸煙者相比，COPD患者誘導(dǎo)痰中IL-8含量顯著升高，測定肺內(nèi)外的IL-8可反應(yīng)COPD患者的病情[6-7]。香煙煙霧誘導(dǎo)IL-8的釋放可能是通過氧化還原介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，特別是NF-κB的激活[8-9]。筆者的數(shù)據(jù)表明吸煙組較健康對照組肺泡灌洗液IL-8含量升高，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），且隨著吸煙時間延長，IL-8水平升高更為顯著。

每一口香煙煙霧中含有大約1017種氧化劑/氧自由基和4700種化合物，包括活性醛和醌類?；钚匀┖王愡€可以進(jìn)一步生成羥自由基。大量的氧化劑和自由基激活氧化應(yīng)激反應(yīng)。GSH是重要的抗氧化劑，對于保持氣道上皮細(xì)胞完整性和抵御肺部損傷與炎癥等方面有重要作用，現(xiàn)常將GSH作為評價氧化反應(yīng)的一個指標(biāo)[10]。筆者的研究發(fā)現(xiàn)吸煙后GSH含量下降，提示香煙煙霧降低GSH水平，并且GSH水平下降和IL-8水平升高具有顯著相關(guān)性（r=-0.63，P<0.05），提示GSH下降與肺泡巨噬細(xì)胞釋放IL-8有關(guān)，與相關(guān)研究一致[11-12]。Hirohiko[13]研究證明戒煙2周就可以改善長期吸煙者的氧化抗氧化失衡狀態(tài)，可以檢測到GSH升高；Tavilani等研究顯示長期吸煙者在戒煙1年后體內(nèi)氧化抗氧化指標(biāo)可恢復(fù)正常，但重新吸煙后GSH等指標(biāo)又再次上升[14-15]。筆者的研究也發(fā)現(xiàn)戒煙后GSH逐漸回升，與既往研究結(jié)果相似。

組蛋白去乙?；讣易灏?1種異構(gòu)體，劃分為三類，Ⅰ類HDACS（HDAC1，2，3，8和11）幾乎只存在于細(xì)胞核內(nèi)，Ⅱ類HDACS（HDAC4，5，6，7，9和10）能夠響應(yīng)于某些細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)之間的信號穿梭，第Ⅲ類功能尚未完全破譯。Ⅰ類HDACS已被證明在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[16]。HDAC2主要參與炎癥反應(yīng)，是Ⅰ類HDAC。最近的報道HDAC2是糖皮質(zhì)激素介導(dǎo)的抗炎活性所必需的酶，糖皮質(zhì)激素通過誘導(dǎo)組蛋白去乙?；傅鞍缀突虮磉_(dá)增加細(xì)胞HDAC2的活性[17]。筆者的研究發(fā)現(xiàn)香煙煙霧介導(dǎo)的IL-8的釋放與HDAC活性下降有關(guān)。有研究通過支氣管鏡活檢COPD患者和吸煙者的肺組織送檢，結(jié)果顯示肺泡巨噬細(xì)胞HDAC活性有顯著下降，并且HDAC活性下降幅度與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)[18-19]。筆者的研究數(shù)據(jù)顯示肺組織HDAC2活性下降與早前的報道一致[20]，隨著吸煙時間的延長，HDAC2活性降低越明顯，戒煙可使之有所恢復(fù)。

總之，本研究為香煙煙霧誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄和增強(qiáng)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制提供了新的重要資料。香煙煙霧導(dǎo)致HDAC活性和HDAC2水平下降，HDAC活性下降與細(xì)胞內(nèi)GSH的消耗有關(guān)。抗氧化劑可能通過升高細(xì)胞內(nèi)GSH，恢復(fù)HDAC活性/水平和廢除香煙煙霧介導(dǎo)的IL-8的釋放來逆轉(zhuǎn)氧化應(yīng)激反應(yīng)，因此有可能作為一種有用的治療方法來調(diào)節(jié)COPD患者細(xì)胞內(nèi)的核信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和高水平的氧化應(yīng)激反應(yīng)。此外，香煙煙霧介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是由細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)來調(diào)節(jié)的。

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（收稿日期：2014-06-30） （本文編輯：王宇）endprint

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