姜清等

【摘要】 目的：探討丹參酮ⅡA對(duì)肝癌細(xì)胞中凋亡抑制蛋白XIAP的影響。方法：通過MTT實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞形態(tài)觀察檢測(cè)丹參酮ⅡA對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響，通過蛋白免疫印跡的方法檢測(cè)丹參酮ⅡA對(duì)細(xì)胞中凋亡抑制蛋白XIAP、凋亡蛋白caspase-3以及PARP蛋白的影響。結(jié)果：MTT、細(xì)胞形態(tài)結(jié)果顯示丹參酮ⅡA對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用成時(shí)間和劑量依賴性，免疫印跡結(jié)果顯示，0.5 μg/mL丹參酮ⅡA作用肝癌細(xì)胞24 h后，caspase-3前體、凋亡抑制蛋白XIAP表達(dá)明顯下調(diào)，活化的caspase-3、剪切形式的PARP含量顯著增加。結(jié)論：丹參酮ⅡA下調(diào)凋亡抑制蛋白XIAP，活化caspase-3，促進(jìn)PARP剪切誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。

【關(guān)鍵詞】 丹參酮ⅡA； 肝癌； 凋亡； XIAP

【Abstract】 Objective：To investigate the effect of inhibitor of apoptosis protein XIAP in hepatocellular carcinoma cells treated with Tanshinone ⅡA.Method：Effect of Tanshinone ⅡA on cell proliferation and apoptosis were determined by MTT test，flow cytometry and cell morphology observation.The effects of Tanshinone ⅡA on inhibitor of apoptosis protein XIAP，apoptosis related proteins procaspase-3 and PARP protein in cells were measured by Western blot.Result：MTT，cell morphology results showed that Tanshinone ⅡA inhibited the growth of SMMC-7721 cells in a dose and time dependent manner，Western blotting results showed that 0.5 μg/mL tanshinone ⅡA in hepatocellular carcinoma cells after 24 h，Caspase-3 precursor，inhibitor of apoptosis protein XIAP expression were down regulated，the content of PARP，caspase-3 splicing activation increased significantly.Conclusion：Tanshinone ⅡA can down regulate XIAP protein，activate caspase-3 and promote PARP shear，and induce apoptosis of hepatocellular carcinoma cells.

【Key words】 Tanshinone ⅡA； Hepatocellular carcinoma； Apoptosis； XIAP

First-authors address：The Peoples Hospital of Xinyu City，Xinyu 338000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.22.004

肝癌屬世界上的較為常見的惡性腫瘤之一，在成人中發(fā)病率較高，約占80%左右，數(shù)據(jù)顯示，其5年存活率在7%左右，每年約60萬人死于肝癌，嚴(yán)重影響人們的健康。近年來，中藥治療腫瘤，尤其是在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡方面的研究，成為醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)方向。尋求誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的中藥提取物逐步成為當(dāng)前腫瘤治療的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。丹參酮ⅡA是中藥丹參中提取出來的有效成分，在抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)細(xì)胞分化、促進(jìn)細(xì)胞凋亡方面有著很好的效果，從而達(dá)到抗癌的效果[1]，但是其具體作用機(jī)制仍然不清楚。X相關(guān)凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）是細(xì)胞中重要的凋亡抑制因子，其過度表達(dá)往往導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[2]。近年來研究表明，XIAP在肝癌細(xì)胞中表達(dá)明顯升高，并且與肝癌轉(zhuǎn)移、耐藥以及復(fù)發(fā)密切相關(guān)[3]。因此，XIAP已經(jīng)成為肝癌治療的靶點(diǎn)分子。本研究工作中，筆者探討丹參酮ⅡA誘導(dǎo)肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡的過程中對(duì)XIAP蛋白的影響，為丹參酮ⅡA用于臨床治療肝癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 丹參酮ⅡA、二甲亞砜（DMSO）、四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）購(gòu)自Solarbio公司，RPMI1640培養(yǎng)基、小牛血清購(gòu)自Gibco公司。兔抗人XIAP、caspase-3、PARP抗體購(gòu)自Cell Signaling公司，鼠抗人-actin抗體購(gòu)自Sigma公司，HRP-羊抗鼠Ig-G、HRP-羊抗兔Ig-G抗體購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，顯影液ECL購(gòu)自Millipore公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 肝癌細(xì)胞株（SMMC-7721）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院。細(xì)胞在含10%小牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、100 U/mL青霉素和100 U/mL的鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，使細(xì)胞密度維持在60%～80%的最佳生長(zhǎng)狀態(tài)。

1.3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 取生長(zhǎng)良好的SMMC-7721細(xì)胞2×103/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，采取不同濃度的丹參酮ⅡA（0、0.5、1、2、5、10、20 g/mL）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，處理時(shí)間為24 h和48 h，每個(gè)濃度做5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入MTT10 L（10 mg/mL），將其進(jìn)行繼續(xù)培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)時(shí)間為4 h，離心去上清后加入DMSO（150 L/孔），于37 ℃條件下將其孵育30 min，使得細(xì)胞得以溶解，用酶標(biāo)儀測(cè)定其在490 nm波長(zhǎng)處的吸光值。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組吸光值/對(duì)照組吸光值）×100%，并通過ICp計(jì)算軟件計(jì)算出藥物作用不同時(shí)間的半數(shù)抑制率（IC50）。

1.4 細(xì)胞形態(tài)觀察 肝癌細(xì)胞及不同濃度丹參酮ⅡA作用后，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞數(shù)量的變化情況并通過攝像記錄。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 SMMC-7721細(xì)胞經(jīng)0.5 μg/mL的丹參酮ⅡA處理24 h后，從其中進(jìn)行細(xì)胞收集，收集的細(xì)胞數(shù)量為1×106個(gè)細(xì)胞，選取PBS緩沖液進(jìn)行沖洗，沖洗次數(shù)為2次，對(duì)其進(jìn)行離心。離心完成后，用300 LPBS重懸，加入700 L無水乙醇，使得乙醇濃度達(dá)到70%，將其放置在-20 ℃環(huán)境下固定過夜，對(duì)其進(jìn)行離心，離心完成后取細(xì)胞沉淀，選取含250 mg/mL的RNaseA的PBS，4 ℃條件下進(jìn)行孵育，孵育時(shí)間為30 min，使得細(xì)胞中的RNA得以去除。然后加入50 LPI（mg/mL）染料，于4 ℃條件下進(jìn)行孵育，孵育時(shí)間為30 min，1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

1.6 蛋白免疫印跡 SMMC-7721細(xì)胞經(jīng)丹參酮ⅡA處理不同時(shí)間后，用蛋白裂解液（100 mmol/L Tris-base、4%SDS、5%-巰基乙醇、20%甘油、pH為6.8）提取蛋白，蛋白經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移至0.45 m的硝酸纖維膜上，然后用相應(yīng)的抗體檢測(cè)蛋白的變化情況，具體方法見文獻(xiàn)[4]。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 丹參酮ⅡA對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖的影響 通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)丹參酮ⅡA對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC-7721的生長(zhǎng)的抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度的丹參酮ⅡA作用細(xì)胞不同時(shí)間后，細(xì)胞生長(zhǎng)受到不同程度的抑制，并成時(shí)間和劑量依賴性（圖1），通過ICp軟件計(jì)算出丹參酮ⅡA作用細(xì)胞24 h時(shí)的半數(shù)抑制濃度（IC50）為2.50 μg/mL，而48 h的IC50為0.46 μg/mL。

2.2 丹參酮ⅡA對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞形態(tài)的影響 SMMC-7721細(xì)胞經(jīng)不同濃度的丹參酮ⅡA處理48 h后，通過倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。結(jié)果顯示，未經(jīng)藥物處理的細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)成條梭型，細(xì)胞折光性好。實(shí)驗(yàn)組經(jīng)藥物處理后，可見細(xì)胞成凋亡形態(tài)學(xué)改變，表現(xiàn)為部分細(xì)胞懸浮，折光性降低，細(xì)胞體積變小、變形；隨著藥物濃度的加大，凋亡的細(xì)胞數(shù)量增加，細(xì)胞形態(tài)改變更明顯（圖2），表明丹參酮ⅡA可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

2.3 丹參酮ⅡA對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡的影響 細(xì)胞用0.5 g/mL的丹參酮ⅡA處理48 h后，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期的變化。從圖3中可以發(fā)現(xiàn)，加藥處理后，G0/G1期細(xì)胞比例明顯增加，有對(duì)照組的53.2%增加到63.0%，而處于S期，G2/M期的細(xì)胞明顯減少。同時(shí)，還看到在G0/G1峰前還出現(xiàn)一個(gè)小峰，代表凋亡的細(xì)胞，這也表明，丹參酮ⅡA可以具有抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的功能。

2.4 丹參酮ⅡA對(duì)凋亡相關(guān)蛋白的影響 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)顯示，0.5 μg/mL的丹參酮ⅡA可以下調(diào)分子量為32 kD的caspase-3前體蛋白，并促進(jìn)PARP蛋白的剪切，使得116 kD的PARP蛋白隨著作用加藥時(shí)間而減少，85 kD的剪切形式的PARP蛋白明顯增加（圖4）。

2.5 丹參酮ⅡA對(duì)凋亡凋亡抑制蛋白XIAP的影響 研究表明，XIAP蛋白是細(xì)胞中唯一可以直接與caspase蛋白相互作用并抑制細(xì)胞凋亡的蛋白，同時(shí)也有報(bào)道XIAP在肝癌細(xì)胞中高表達(dá)。筆者檢測(cè)了丹參酮ⅡA對(duì)肝癌細(xì)胞中XIAP的影響，Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，丹參酮ⅡA處理細(xì)胞6 h后，細(xì)胞中的XIAP就開始下降，24 h后就明顯下降（圖5）。

3 討論

丹參酮ⅡA是從活血化瘀的中藥丹參中提取脂溶性有效成分，其結(jié)構(gòu)中含有醌型結(jié)構(gòu)，容易被氧化還原，能夠和機(jī)體內(nèi)的多種生化反應(yīng)共同發(fā)生，生物活性較強(qiáng)[4]。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮在臨床上治療心血管疾病和關(guān)節(jié)炎方面，有著很好的療效。近年來，部分研究資料表明，丹參酮ⅡA具有抗腫瘤活性，能夠在腫瘤細(xì)胞的殺傷、誘導(dǎo)、分化方面發(fā)揮較好的作用[5]。本研究顯示，0.5～10 g/mL丹參酮ⅡA均能抑制肝癌細(xì)胞SMMC-7721細(xì)胞生長(zhǎng)，并且這以生長(zhǎng)抑制作用具有明顯的時(shí)間和劑量依賴性。同時(shí)通過形態(tài)觀察、細(xì)胞周期分析，發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA處理細(xì)胞后，細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)凋亡改變，處于G0/G1期的細(xì)胞明顯增加，而處于S期、G2/M期的細(xì)胞含量明顯減少，同時(shí)還出現(xiàn)亞G1峰的細(xì)胞，這提示細(xì)胞發(fā)生了凋亡，提示丹參酮ⅡA的作用與誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。

凋亡抑制蛋白XIAP（X-linked inhibitor of apoptosis protein）也叫做MIHA/hILP/BIRC4，基因定位于人Xq25，共含有7外顯子和6內(nèi)含子，其mRNA全長(zhǎng)8413 bp，編碼區(qū)位于129～1622 bp之間，其編碼的蛋白XIAP相對(duì)分子量約57 kDa[6]。研究表明，XIAP分子可以選擇性的直接結(jié)合和抑制啟動(dòng)凋亡的凋亡蛋白caspase-9和發(fā)生凋亡效應(yīng)的凋亡蛋白caspase-3和caspase-7，但是不能抑制其他caspase的活性，表明XIAP在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要的作用[7]。近年來研究表明，XIAP在肝癌細(xì)胞以及肝癌組織中表達(dá)都比在正常組織細(xì)胞中的要高，這一研究結(jié)果證明XIAP可能與肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程有著一定的相關(guān)性[8-9]。有研究發(fā)現(xiàn)在肝癌細(xì)胞中過表達(dá)XIAP可以使得肝癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)發(fā)生率增加[10]。該研究可以得出，約90%的患者在病情發(fā)展到進(jìn)展期的肝癌時(shí)候，其腫瘤細(xì)胞中XIAP的表達(dá)有明顯的提升[11-12]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA可以下調(diào)XIAP蛋白，同時(shí)可以減少caspase-3前體的表達(dá)，促進(jìn)PARP蛋白的剪切，PARP蛋白是細(xì)胞核中的骨架蛋白，PARP蛋白的剪切可導(dǎo)致細(xì)胞核破壞，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。這表明丹參酮ⅡA可能是通過調(diào)節(jié)XIAP蛋白的表達(dá)來誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的，但是丹參酮ⅡA調(diào)控XIAP的機(jī)制并不清楚，接下來筆者還將繼續(xù)探討其分子機(jī)制。

在本文中，丹參酮ⅡA下調(diào)凋亡抑制蛋白XIAP并誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞SMMC-7221細(xì)胞凋亡，為丹參酮ⅡA治療肝癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論支持。

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（收稿日期：2014-02-28） （本文編輯：歐麗）

在本文中，丹參酮ⅡA下調(diào)凋亡抑制蛋白XIAP并誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞SMMC-7221細(xì)胞凋亡，為丹參酮ⅡA治療肝癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論支持。

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（收稿日期：2014-02-28） （本文編輯：歐麗）

在本文中，丹參酮ⅡA下調(diào)凋亡抑制蛋白XIAP并誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞SMMC-7221細(xì)胞凋亡，為丹參酮ⅡA治療肝癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論支持。

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（收稿日期：2014-02-28） （本文編輯：歐麗）