南平，王瓊瓊，亓蒙，翟勝娜，張玉玲，易叔紅，常重杰

河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，新鄉(xiāng) 453007

離子液體[C8mim]Cl對(duì)泥鰍胚胎和仔魚(yú)的毒性

南平，王瓊瓊，亓蒙，翟勝娜，張玉玲，易叔紅，常重杰*

河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，新鄉(xiāng) 453007

以泥鰍的胚胎及仔魚(yú)為試驗(yàn)材料，選擇胚胎發(fā)育的4個(gè)不同時(shí)期(囊胚期、原腸胚中期、神經(jīng)胚期、尾芽期)及仔魚(yú)期為處理開(kāi)始的時(shí)間點(diǎn)，探討了離子液體[C8mim]Cl的毒性作用。結(jié)果表明，隨著[C8mim]Cl濃度增加，泥鰍胚胎的孵化率下降，畸形率上升，具有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，67～150 mg·L-1的[C8mim]Cl對(duì)泥鰍胚胎均表現(xiàn)出明顯的致畸毒性效應(yīng)；隨著[C8mim]Cl濃度增加，泥鰍仔魚(yú)死亡率上升，而100～225 mg·L-1的[C8mim]Cl對(duì)泥鰍仔魚(yú)具有明顯的致畸、致死作用。其中，[C8mim]Cl對(duì)孵出期泥鰍仔魚(yú)的24 h、48 h的半致死濃度分別為97.95和86.77 mg·L-1；而[C8mim]Cl對(duì)孵出后3 d泥鰍仔魚(yú)的24 h、48 h的半致死濃度分別為73.77和40.98 mg·L-1。由上可知,在一定的劑量?jī)?nèi)，[C8mim]Cl對(duì)泥鰍胚胎及仔魚(yú)的發(fā)育有明顯的致畸、致死作用，這為離子液體[C8mim]Cl的合理使用提供了理論依據(jù)。

泥鰍；[C8mim]Cl；胚胎發(fā)育；毒性

離子液體是一類完全由離子組成的室溫下呈液態(tài)的新型化學(xué)試劑，因其不揮發(fā)、不易燃和熱穩(wěn)定等優(yōu)勢(shì)，具有廣闊的應(yīng)用前景，曾被認(rèn)為是環(huán)境友好的“綠色溶劑”。然而近幾年研究發(fā)現(xiàn)離子液體對(duì)環(huán)境和生物體有潛在風(fēng)險(xiǎn)，有些離子液體甚至是強(qiáng)毒性的[1-2]。此外，大部分離子液體水溶性較強(qiáng)，在其合成和應(yīng)用中，它們很可能通過(guò)廢液殘留、工業(yè)污水排放等途徑進(jìn)入水體中，從而對(duì)環(huán)境特別是水環(huán)境產(chǎn)生潛在的威脅[3]。目前，有關(guān)離子液體生物毒性的研究還處于初步階段，國(guó)內(nèi)外的研究報(bào)告多集中于不同類型的離子液體對(duì)各種生物體的急性毒性效應(yīng)方面[3-5]。本研究以泥鰍為受試動(dòng)物，研究了離子液體對(duì)水生生物的胚胎發(fā)育毒性和仔魚(yú)的生物毒性效應(yīng)，旨在探討離子液體對(duì)水生生物的毒性影響。

泥鰍(Misgurnus anguillicaudatus)屬鯉形目、鰍科、泥鰍屬，分布較廣，且易于在實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。因此，在毒性試驗(yàn)研究中，是理想的水生生物試驗(yàn)材料[6]。另外，已有研究表明：魚(yú)類的胚胎期和仔魚(yú)期是整個(gè)生活史中對(duì)各種藥物最為敏感的時(shí)期[7]。因此，可以利用其胚胎和仔魚(yú)來(lái)評(píng)價(jià)多種化合物及各種環(huán)境的毒性影響。目前，已有關(guān)于斑馬魚(yú)、金魚(yú)、草魚(yú)、鯉魚(yú)、黑鯛等水生生物胚胎毒性試驗(yàn)的報(bào)道[8-12]，但有關(guān)咪唑類離子液體氯化1-辛基-3-甲基咪唑([C8mim]Cl)對(duì)泥鰍的胚胎毒性的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究探討了[C8mim]Cl對(duì)泥鰍胚胎及仔魚(yú)的毒性影響，從而為制定離子液體[C8mim]Cl水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)及漁業(yè)用水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

成體泥鰍(體重20～30 g，體長(zhǎng) 13～17 cm)，購(gòu)于河南新鄉(xiāng)市鴻達(dá)市場(chǎng)。[C8mim]Cl，純度>99%，購(gòu)自上海成捷化學(xué)有限公司；絨毛膜促性腺激素(HCG)，購(gòu)于新鄉(xiāng)市獸醫(yī)藥店。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

受精卵的制備：在生殖季節(jié)，選取性成熟雌雄泥鰍各10尾，采用背部肌肉注射法注射獸用絨毛膜促性素(HCG)，其中雌魚(yú)為800 IU·尾-1；雄魚(yú)注射劑量減半。10～14 h 后，輕壓雌鰍腹部，立即將卵收集于不同的培養(yǎng)皿中，干法受精[2]，獲得受精卵，備用。

試驗(yàn)設(shè)計(jì)：參照預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，設(shè)30、44、67、100、150、225 mg·L-1共6個(gè)處理組和1個(gè)空白對(duì)照組，每組均設(shè)3個(gè)平行樣，置于直徑12 cm的培養(yǎng)皿中(100受精卵/培養(yǎng)皿)。在胚胎染毒組，選取30～150 mg·L-1共5個(gè)處理濃度的離子液體溶液[C8mim]Cl(100 mL/培養(yǎng)皿)，分別于囊胚期、原腸胚中期、神經(jīng)胚期和尾芽期開(kāi)始處理；而在仔魚(yú)孵出期和卵黃吸收期則選擇44～225 mg·L-1共5個(gè)處理濃度的[C8mim]Cl(100 mL/培養(yǎng)皿)進(jìn)行染毒處理，每24 h更新其相應(yīng)的處理液、及時(shí)剔除死亡個(gè)體，并利用解剖顯微鏡連續(xù)觀察其發(fā)育狀況并及時(shí)拍照、記錄。其中仔魚(yú)各處理組在處理48 h后終止試驗(yàn)(仔魚(yú)卵黃囊吸收完畢后每天上、下午各投喂1次蛋黃)，其他處理組在仔魚(yú)孵化出后即終止試驗(yàn)。根據(jù)文獻(xiàn)[2]的計(jì)算公式，計(jì)算出各處理組的胚胎孵化率、畸形率，及其仔魚(yú)半致死濃度，并推算出其相應(yīng)的安全濃度。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，用最小顯著差數(shù)法(LSD)進(jìn)行多重比較，同時(shí)還利用了Excel 2003進(jìn)行分析作圖，數(shù)據(jù)結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。顯著性差異以p值表示，p< 0.05(*)表示差異顯著；p< 0.01(**)表示差異極顯著。

2 結(jié)果(Results)

2.1 [C8mim]Cl對(duì)泥鰍胚胎孵化率、畸形率的影響

[C8mim]Cl對(duì)泥鰍胚胎發(fā)育的影響如圖1和圖2所示?？傮w而言，其胚胎的主要致畸癥狀表現(xiàn)為：受精卵發(fā)育異常，如胚盤異常凸起(圖1A)，胚盤下包異常(圖1B)，胚體渾濁或自行解體(圖1C)；卵黃吸收異常，如卵黃膨大、崩解等(圖1D)。與對(duì)照組比較，隨著離子液體[C8mim]Cl濃度的增加，胚胎孵化率下降，其中，較高濃度處理組(100～150 mg·L-1)顯著下降(p< 0.01)，具有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系；同時(shí)，[C8mim]Cl對(duì)泥鰍胚胎有明顯的劑量-致畸效應(yīng)關(guān)系，胚胎畸形率隨[C8mim]Cl的濃度增加而上升，其較高處理組(44～150 mg·L-1)的畸形率上升達(dá)極顯著水平(p< 0.01)。而比較4個(gè)不同處理時(shí)期的處理效應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從囊胚期開(kāi)始處理時(shí)，胚胎的孵化率受抑制作用最強(qiáng)；而尾芽期開(kāi)始處理時(shí)其胚胎畸形率最顯著。

圖1 [C8mim]Cl對(duì)泥鰍(Misgurnus anguillicaudatus)胚胎、仔魚(yú)的毒性效應(yīng)注：A1，正常囊胚；A2，畸形囊胚；B1，正常原腸胚；B2，畸形原腸胚；C1，正常神經(jīng)胚；C2， 畸形神經(jīng)胚；D1，正常尾芽；D2，畸形尾芽；E1，正常仔魚(yú)；E2，畸形仔魚(yú)。Fig. 1 Toxic effect of [C8mim]Cl on the embryos and larvae of loach (Misgurnus anguillicaudatus)Note: A1, normal blastaea; A2, malformed blastaea; B1, normal gastrula; B2, malformed gastrula; C1, normal neurula; C2, malformed neurula; D1, normal tail bud; D2, malformed tail bud; E1 , normal laval fish; E2, malformed laval fish.

圖2 [C8mim]Cl對(duì)泥鰍胚胎孵化率和畸形率的影響注：A，囊胚期處理；B，原腸胚期處理；C，神經(jīng)胚期處理；D，尾芽期處理。Fig. 2 Effect of [C8mim]Cl on the hatching rate and abnormal embryo rate of M. anguillicaudaius embryosNote: A, blastoderm stage processing; B, mid-gastrulae stage processing; C, neurula stage processing; D, tail bud stage processing.

2.2 [C8mim]Cl對(duì)泥鰍仔魚(yú)死亡率的影響

[C8mim]Cl對(duì)泥鰍仔魚(yú)死亡率的影響結(jié)果如表1所示。在處理1～2 h時(shí)，泥鰍仔魚(yú)活動(dòng)開(kāi)始加快。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，仔魚(yú)表現(xiàn)出明顯的致畸癥狀，如彎體或彎尾等(圖1E)，且其攝食能力明顯降低，最終死亡。由表1可知，隨著[C8mim]Cl濃度的增加，泥鰍仔魚(yú)的死亡率增加。根據(jù)改進(jìn)的寇氏法(Karber)可推算出[C8mim]Cl對(duì)孵出期泥鰍仔魚(yú)的24 h、48 h的LC50濃度及安全濃度分別為：97.95、86.77、20.43 mg·L-1，而其對(duì)孵出3 d的泥鰍仔魚(yú)的24 h、48 h的LC50濃度及安全濃度分別為：73.77、40.98、3.794 mg·L-1。由上可知，剛孵化出的泥鰍仔魚(yú)24 h、48 h的LC50濃度及安全濃度均高于孵化后3 d的泥鰍仔魚(yú)。

表1 [C8mim]Cl染毒后泥鰍仔魚(yú)的死亡率Table 1 Mortality rate of M. anguillicaudaius larvae induced by [C8mim]Cl

3 討論(Discussion)

離子液體因沒(méi)有蒸汽壓，在使用過(guò)程中本身不會(huì)形成揮發(fā)性有機(jī)物而被稱為“綠色產(chǎn)品”，被認(rèn)為是工業(yè)上揮發(fā)性的有機(jī)化合物的綠色替代品。但離子液體本身并非“綠色”產(chǎn)品，某些離子液體有毒且難以降解[13-14]。另外，離子液體雖降低了對(duì)空氣污染的可能性，但是，因其具有極大的水溶性，排放到環(huán)境中后，將對(duì)水環(huán)境造成危害。因此，Ranke等[15]提出應(yīng)結(jié)合多學(xué)科知識(shí)對(duì)其潛在危害性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

本研究探討了[C8mim]Cl對(duì)泥鰍的胚胎及其仔魚(yú)的毒性效應(yīng)，選擇胚胎發(fā)育的4個(gè)不同時(shí)期(囊胚期、原腸胚期、神經(jīng)胚期、尾芽期)，以及剛孵化出的仔魚(yú)為處理開(kāi)始的時(shí)間點(diǎn)，分別以泥鰍胚胎的孵化率和畸形率，泥鰍仔魚(yú)的死亡率為研究指標(biāo)。結(jié)果表明，[C8mim]Cl對(duì)泥鰍胚胎及仔魚(yú)的發(fā)育具有明顯的抑制、致畸、致死作用，如67～150 mg·L-1的[C8mim]Cl對(duì)泥鰍胚胎均表現(xiàn)出明顯的致畸毒性效應(yīng)；隨著[C8mim]Cl的濃度增加，泥鰍仔魚(yú)死亡率上升，而100～225 mg·L-1的[C8mim]Cl對(duì)泥鰍仔魚(yú)具有明顯的致畸、致死作用。其中，[C8mim]Cl對(duì)孵出期泥鰍仔魚(yú)的24 h、48 h的LC50分別為97.95和86.77 mg·L-1；而[C8mim]Cl對(duì)孵出后3 d泥鰍仔魚(yú)的24 h、48 h的LC50分別為73.77和 40.98 mg·L-1。這與其他咪唑類離子液體對(duì)斑馬魚(yú)、大型蚤等其他水生生物具有生物毒性的研究成果一致[16-18]。由上可知，在一定的劑量?jī)?nèi)，[C8mim]Cl對(duì)泥鰍胚胎及仔魚(yú)的發(fā)育有明顯的致畸、致死作用，這為離子液體[C8mim]Cl的合理使用提供了理論依據(jù)。同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)胚和尾芽期，泥鰍胚胎對(duì)[C8mim]Cl的毒性影響較為敏感，其畸形率較其他時(shí)期明顯增高。這可能是因?yàn)椋窠?jīng)胚期的胚胎正處于高度分化時(shí)期，尤其是胚頭部等重要的神經(jīng)系統(tǒng)在此時(shí)趨于形成，此時(shí)受到毒性影響，較易形成畸形個(gè)體；而尾芽期距孵出期比較短，其卵細(xì)胞膜的保護(hù)作用有所減弱。同時(shí)，本研究結(jié)果也說(shuō)明，不同時(shí)期胚胎發(fā)育的敏感性有差異。另外，不同孵出期的泥鰍仔魚(yú)對(duì)[C8mim]Cl的敏感性有差異，孵出后1 d進(jìn)行處理的仔魚(yú)比孵出后3 d進(jìn)行處理的仔魚(yú)的半致死濃度及安全濃度高。這說(shuō)明，早期幼魚(yú)(卵黃吸收期的仔魚(yú)：孵出后1～3 d)，營(yíng)養(yǎng)供給主要是靠卵黃提供，受外界的影響并不大；但隨著發(fā)育的進(jìn)行，幼魚(yú)對(duì)外界的敏感性增強(qiáng)。該結(jié)果與姚紀(jì)花等[19]研究重金屬對(duì)大鱗副泥鰍胚胎發(fā)育和仔魚(yú)成活的影響結(jié)果基本一致。

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◆

Toxicityof[C8mim]CltoLoachEmbryonicandLarvalFish

Nan Ping, Wang Qiongqiong, Qi Meng, Zhai Shengna, Zhang Yuling, Yi Shuhong, Chang Zhongjie*

College of Life Sciences, Henan Normal University, Xinxiang 453007, China

25 July 2013accepted11 November 2013

The toxic effect of chloride-1-helsinki-3-methylimidazolium chinook ([C8mim]Cl) to the embryos and larvae of loach (Misgurnus anguillicaudatus) were studied in this paper. The loaches were exposed to [C8mim]Cl from the beginning of different stages including the embryonic development of blastoderm, mid-gastrula, neurula and tail bud stage, and the larval period. The results showed that the hatching rate of loach embryos decreased and the abnormality of loach embryos increased with the increase of [C8mim]Cl concentration, and a significant dose-response relationship was observed. [C8mim]Cl showed significant toxicity to the loach embryonic development at the concentration between 67 and 150 mg·L-1. The mortality of loach larvae increased with the increase of [C8mim]Cl concentration, and the teratogenic and lethal effect of [C8mim]Cl on the loach larvae was observed at the concentration between 100 and 225 mg·L-1. The 24 h-LC50and 48 h-LC50of the newly hatched larvae were 97.95 and 86.77 mg·L-1, whereas the 24 h-LC50and 48 h-LC50of the 3-day-old larvae were 73.77 and 40.98 mg·L-1. This study provides some useful information for the rational use of [C8mim]Cl.

loach (Misgurnus anguillicaudatus); [C8mim]Cl; embryonic development; toxicity

國(guó)家自然科學(xué)基金(3071666)；河南師范大學(xué)青科基金(01046400067)；河南師范大學(xué)研究生創(chuàng)新項(xiàng)目(YL201313)；河南省自然科學(xué)基礎(chǔ)與前沿(112300410275)

南平(1979-)，女，博士，講師，研究方向?yàn)榄h(huán)境分子毒理學(xué)，E-mail: nanspring@sohu.com；

*通訊作者(Corresponding author)，E-mail: changzhongjie@tom.com

10.7524/AJE.1673-5897.20130725001

南平，王瓊瓊，亓蒙，等. 離子液體[C8mim]Cl對(duì)泥鰍胚胎和仔魚(yú)的毒性研究[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào), 2014, 9(2): 268-272

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2013-07-25錄用日期2013-11-11

1673-5897(2014)2-268-05

X171.5

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常重杰(1965—)，男，博士，教授，主要研究方向?yàn)榉肿蛹?xì)胞毒理學(xué)，發(fā)表學(xué)術(shù)論文60余篇。