余大啟 涂豫海 來魯華，*

(1北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，分子動態(tài)與穩(wěn)態(tài)國家重點實驗室，北京分子科學(xué)國家實驗室，北京100871;2北京大學(xué)定量生物學(xué)中心，北京100871;3IBM T.J.Watson Research Center，Yorktown Heights，NY 10598，USA)

1 引言

細(xì)菌可以檢測環(huán)境中的化學(xué)物質(zhì)從而游向其化學(xué)引誘劑和遠(yuǎn)離其化學(xué)排斥物.1這種被稱為化學(xué)趨向性的現(xiàn)象幫助細(xì)菌尋找食物并遠(yuǎn)離有害物質(zhì)的傷害.1，2在引誘劑誘導(dǎo)的細(xì)菌趨化過程中，細(xì)胞膜上的化學(xué)趨向性受體通過結(jié)合引誘劑分子傳導(dǎo)跨膜信號以降低其下游組氨酸激酶CheA的活性.3CheA活性的變化進(jìn)一步影響到控制馬達(dá)轉(zhuǎn)動的激酶CheY和去甲基化酶CheB的磷酸化水平，從而改變鞭毛的運(yùn)動狀態(tài)以及化學(xué)趨向性受體的甲基化狀態(tài)，最終改變細(xì)菌的游動方向并實現(xiàn)對于化學(xué)物質(zhì)的適應(yīng)性.3，4由于整個控制系統(tǒng)中含有的分子種類比較少，細(xì)菌的趨化系統(tǒng)經(jīng)常被當(dāng)作刺激-響應(yīng)二組分調(diào)控系統(tǒng)(two component regulatory system)的模型系統(tǒng)進(jìn)行研究.3，4

根據(jù)結(jié)合配體的不同，化學(xué)趨向性受體分為很多種.大腸桿菌中最主要的有結(jié)合絲氨酸(Ser)的受體(Tsr)和結(jié)合天冬氨酸(Asp)的受體(Tar).3兩個Tsr單體分子或Tar單體分子可以形成穩(wěn)定的同源二聚體并在界面上提供兩個結(jié)合口袋以結(jié)合引誘劑.3引誘劑結(jié)合之后會誘導(dǎo)受體二聚體中第4號跨膜螺旋向下滑動進(jìn)而傳遞跨膜信號，5而非引誘劑即使能結(jié)合這兩個口袋也不能傳遞跨膜信號.6雖然二聚體通過結(jié)合誘導(dǎo)的構(gòu)象變化已經(jīng)比較清楚，但是二聚體進(jìn)一步二聚形成的復(fù)雜多聚化結(jié)構(gòu)尚不夠清楚.根據(jù)Tsr胞質(zhì)區(qū)的X射線晶體結(jié)構(gòu)，7Tsr二聚體的尾部存在進(jìn)一步三聚的殘基-殘基相互作用，形成倒金字塔(inverted pyramid)形狀的二聚體的三聚體(trimer-of-dimers，TOD)，如圖1所示.

在CheA和耦合蛋白CheW的幫助下，這些化學(xué)趨向性受體在細(xì)胞膜上聚集并主要定位在細(xì)胞兩極，8形成大小不一的受體團(tuán)簇.這些受體團(tuán)簇的大小呈指數(shù)分布，9較大的團(tuán)簇能達(dá)到含數(shù)千個受體的規(guī)模.9理論研究表明，在細(xì)胞膜上聚集的受體能協(xié)同性地影響周圍受體的結(jié)構(gòu)從而放大信號.4，10對聚集體結(jié)構(gòu)的研究不僅能豐富目前高度簡化的理論模型，也能從分子層次上理解受體構(gòu)象協(xié)同耦合的本質(zhì).42003年，Weis等11利用電鏡(EM)技術(shù)研究了過量表達(dá)Tsr然后破碎的大腸桿菌細(xì)胞膜提取物.在這些提取物中存在三種類型的細(xì)胞膜-受體聚集體形式，即球形膠束狀、小型晶體陣列狀以及拉鏈狀.分析表明在球形膠束狀和小型晶體陣列狀聚集體中Tsr都以晶體結(jié)構(gòu)中觀察到的TOD為基本結(jié)構(gòu)單元，而拉鏈狀聚集形式則通過Tsr二聚體中復(fù)繞的螺旋(coiled-coil helix)尾部相互疊合形成.11，12通過統(tǒng)計多個拉鏈狀聚集體較低分辨率(~2 nm)的圖片，得到平均的尾部疊合長度為(6.5±0.6)nm.類似的拉鏈狀聚集形式也存在于Tar、CheA以及CheW的復(fù)合物溶液結(jié)構(gòu)中.13不僅如此，冷凍電鏡研究結(jié)果14也表明，大腸桿菌細(xì)胞在過量表達(dá)受體Tsr時失去趨化功能且在細(xì)胞膜上出現(xiàn)大量的拉鏈狀聚集形式并伴隨著細(xì)胞膜的內(nèi)陷變形.有趣的是，同時過量表達(dá)Tsr、CheA和CheW的細(xì)胞能恢復(fù)趨化功能且在細(xì)胞膜上恢復(fù)正常的聚集形式.考慮到細(xì)菌化學(xué)趨向性受體胞質(zhì)區(qū)的尾部殘基都很保守，11，12這種拉鏈狀聚集被認(rèn)為在化學(xué)趨向性受體聚集中是廣泛存在的結(jié)構(gòu).然而，形成拉鏈狀聚集的分子模型和分子水平的相互作用機(jī)制仍然缺乏，不同聚集形式之間的轉(zhuǎn)換過程和機(jī)制也完全不清楚.本文通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)對接方法15研究兩個Tsr二聚體可能形成的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)形成倒金字塔形TOD和拉鏈狀聚集的基本作用單元，確定拉鏈狀復(fù)合物的結(jié)構(gòu)模型，通過分子動力學(xué)(MD)模擬的方法確定其穩(wěn)定性，并進(jìn)一步討論復(fù)合物界面相互作用特征.

2 計算方法

2.1 化學(xué)趨向性受體二聚體的分子對接

對接計算所用結(jié)構(gòu)來源于大腸桿菌Tsr的胞質(zhì)區(qū)X射線晶體結(jié)構(gòu)(圖1，PDB代碼:1QU77)，該結(jié)構(gòu)具有三重對稱性，每一個不對稱單位中包含1個二聚體，由兩個分別具有227和221殘基長度的單體組成.對Tsr二聚體取coiled-coil螺旋尾部N322-T453共264個殘基為受體二聚體的結(jié)構(gòu)(圖2).這264個殘基組成的coiled-coil螺旋長度大約為9.3 nm，比EM實驗11，12中觀察到的拉鏈狀聚集的尾部疊合長度(6.5 nm)要長，當(dāng)然也遠(yuǎn)長于晶體結(jié)構(gòu)中TOD重疊的長度.將該二聚體作為對接的受體和配體，使用ZDOCK 3.0程序16進(jìn)行對接，計算采用缺省參數(shù)，即平動自由度由快速傅里葉變換(FFT)處理，轉(zhuǎn)動歐拉角格子大小為15°，輸出程序打分排名前2000的復(fù)合物坐標(biāo).對所有對接產(chǎn)生的復(fù)合物，利用Charmm力場17結(jié)合GBSW隱式水模型18在CHARMM C33b119中進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的坐標(biāo)作為對接結(jié)果的研究對象.為研究復(fù)合物中兩個受體二聚體之間的夾角，我們定義沿著尾部A362-I421(圖2中紅色線框內(nèi)部)的最長慣性主軸且指離尾部的方向為受體二聚體的方向(圖2中藍(lán)色箭頭).倒金字塔式復(fù)合物模型的選擇主要依賴二聚體之間的角度和晶體結(jié)構(gòu)，而拉鏈狀復(fù)合物模型的選擇則主要依賴二聚體之間的角度和EM11，12中測量出的平均尾部疊合長度.

圖1 絲氨酸受體Tsr胞質(zhì)區(qū)晶體結(jié)構(gòu)中的TOD結(jié)構(gòu)(PDB代碼:1QU77)Fig.1 TOD structure in the crystal structure of serine chemoreceptor Tsr cytoplasmic domain(PDB code:1QU77)TOD:trimer-of-dimers

2.2 分子動力學(xué)模擬

對確認(rèn)的拉鏈狀復(fù)合物模型和晶體結(jié)構(gòu)TOD中兩個二聚體的復(fù)合物利用Gromacs 4.5.4程序20進(jìn)行了MD模擬.考慮到系統(tǒng)中不存在小分子，為了更好地研究這些復(fù)合物在水溶液中的穩(wěn)定性，模擬使用OPLS-AA力場21描述蛋白質(zhì)，使用TIP3P模型22描述水分子.為了允許較大的構(gòu)象變化，在復(fù)合物兩側(cè)三個方向各加入1.2 nm的水層.整個系統(tǒng)中含有8個單位的負(fù)電荷，加入8個Na+以平衡整個系統(tǒng)的電荷，并加入0.1 mol·L-1的NaCl以模擬生理條件.每個最終得到的模擬系統(tǒng)中均含有約80000個原子，具體原子數(shù)目隨著初始結(jié)構(gòu)的不同有一定的變化.

圖2 用來對接的受體Tsr二聚體結(jié)構(gòu)及其方向Fig.2 Tsr dimer structure and direction used for docking

圖3 具有不同二聚體夾角的對接復(fù)合物數(shù)量Fig.3 Counts for docking complexes with different dimer angles

3 結(jié)果與討論

3.1 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)對接結(jié)果

由ZDOCK計算生成了程序打分排名前2000的二聚體-二聚體復(fù)合物結(jié)構(gòu).對每個結(jié)構(gòu)按照前述對二聚體方向的定義計算二聚體之間的夾角，并統(tǒng)計具有不同夾角的復(fù)合物分布情況(圖3).注意這里計算的具體分布與輸出排名靠前的文件個數(shù)有關(guān)，但這2000個復(fù)合物涵蓋了[0°，180°]的范圍，使得進(jìn)一步的研究成為可能.

圖4 類倒金字塔形復(fù)合物與TOD中的兩個二聚體的最小Cα-RMSD值Fig.4 Minimal Cα-RMSD between the inverted pyramid like complexes and any two dimers in TOD RMSD:root mean square deviation

圖5 類倒金字塔形復(fù)合物與晶體結(jié)構(gòu)TOD的對齊顯示Fig.5 Alignments of inverted pyramid like complexes and crystal structures in TOD

首先研究接近晶體結(jié)構(gòu)TOD中夾角的復(fù)合物.計算晶體結(jié)構(gòu)TOD中兩個二聚體的夾角，結(jié)果為17.5°.這一計算結(jié)果與前人根據(jù)胞質(zhì)區(qū)二聚體長度以及TOD中二聚體在跨膜區(qū)之間的距離粗略地算出的20°夾角23，24相近，具體數(shù)值根據(jù)計算方法的不同可能會有5°以內(nèi)的差別.這里以20°為中心，定義夾角位于[15°，25°]的復(fù)合物為類倒金字塔形復(fù)合物，共有82個.分別計算這些復(fù)合物與晶體結(jié)構(gòu)TOD中任意兩個二聚體之間均方根位移(RMSD)的最小值(圖4).這82個復(fù)合物中最小的RMSD值為0.16 nm.對應(yīng)復(fù)合物(圖5(a))的二聚體之間夾角為17.2°.對齊顯示(圖5(a))表明通過對接能找到十分接近于晶體結(jié)構(gòu)TOD的倒金字塔復(fù)合物.用ZDOCK進(jìn)一步將這個二聚體-二聚體的復(fù)合物和晶體結(jié)構(gòu)TOD中的一個二聚體對接，生成打分排名前2000的二聚體的三聚體，并計算它們與晶體結(jié)構(gòu)TOD的Cα-RMSD值.具有最小Cα-RMSD值 (0.24 nm)的復(fù)合物結(jié)構(gòu)(圖5(b))與晶體結(jié)構(gòu)TOD很相似，特別在靠近尾部的界面上十分吻合(圖5(c)).

圖6 類拉鏈狀復(fù)合物二聚體尾部之間的疊合長度Fig.6 Overlap length of dimer tips in zipper like complexes

兩個二聚體一般會以反平行方式形成拉鏈狀結(jié)構(gòu)，因此定義二聚體夾角位于[170°，180°]的復(fù)合物為類拉鏈狀復(fù)合物，共有24個.對每個復(fù)合物，定義兩個二聚體尾部之間的疊合長度為二聚體最終端部殘基E391的平均坐標(biāo)沿著最長主軸方向的投影距離.計算得到的二聚體尾部疊合長度示于圖6.我們?nèi)∑渲形膊刊B合長度位于[5.5 nm，7.5 nm]的8個復(fù)合物結(jié)構(gòu)(圖7(a))，分析表明這8個復(fù)合物可以分為兩類，分別分布在二聚體的兩側(cè).在大規(guī)模的拉鏈狀聚集時，二聚體可以同時利用兩側(cè)界面形成擴(kuò)展的團(tuán)簇結(jié)構(gòu).對每一類取最接近EM實驗11中拉鏈狀聚集的尾部疊合長度((6.5±0.6)nm)的結(jié)構(gòu)作為最終的拉鏈狀復(fù)合物結(jié)構(gòu)模型(圖7(b))，它們分別具有7.23和6.72 nm的疊合長度，與EM11中測出的(6.5±0.6)nm接近.觀察發(fā)現(xiàn)它們主要在尾部N346-L434之間疊合.下文分別稱它們?yōu)槔湢钅Ｐ?zipper model)1和2.

圖7 類拉鏈狀復(fù)合物結(jié)構(gòu)Fig.7 Structures for zipper like complexes

圖8 N346-L434殘基的Cα-RMSD在MD模擬過程中的變化Fig.8 Cα-RMSD changes for residues within N346-L434 during MD simulations

3.2 分子動力學(xué)模擬結(jié)果

對拉鏈狀復(fù)合物的兩個模型以及晶體結(jié)構(gòu)中的倒金字塔復(fù)合物結(jié)構(gòu)各進(jìn)行了20 ns的MD模擬.圖8顯示的是這三個結(jié)構(gòu)在拉鏈狀復(fù)合物的尾部疊合區(qū)N346-L434之間89個殘基的Cα坐標(biāo)與起始結(jié)構(gòu)之間的RMSD隨模擬時間的變化.三個復(fù)合物與初始結(jié)構(gòu)的CαRMSD都不超過0.3 nm，說明兩個拉鏈狀復(fù)合物模型都比較穩(wěn)定.

分別對這三個結(jié)構(gòu)模型計算了尾部疊合區(qū)Cα原子的均方根漲落(RMSF)(圖9).相對倒金字塔復(fù)合物結(jié)構(gòu)，拉鏈狀復(fù)合物結(jié)構(gòu)在F373-I377之間的RMSF明顯較小，可以推測這些區(qū)域?qū)Y(jié)合的貢獻(xiàn)是比較大的.

3.3 相互作用分析

圖9 N346-L434殘基的Cα原子的RMSFFig.9 RMSF for Cαatoms in the residues within N346-L434

對拉鏈狀復(fù)合物結(jié)構(gòu)的兩個模型，用APBS程序25分別計算四個二聚體單獨存在條件下的靜電勢分布，并用高瑩等26，27發(fā)展的PP_SITE程序計算界面上的關(guān)鍵疏水和氫鍵作用殘基.將表面勢疊合到對應(yīng)的復(fù)合物結(jié)構(gòu)上以分析復(fù)合物結(jié)合界面的帶電性質(zhì)(圖10)，并計算復(fù)合物受體二聚體周圍0.4 nm的配體二聚體的帶電及疏水殘基(圖10(b，c)，正電的示為藍(lán)色，負(fù)電的示為紅色，疏水的示為綠色).可見拉鏈狀模型1(圖10(a，b))和拉鏈狀模型2(圖10(c，d))只有少量差別，主要集中在復(fù)合物界面的邊緣.例如，對拉鏈狀模型1，配體二聚體中的E436、D429(靠近coiled-coil螺旋尾部)和R415(靠近界面邊緣)與受體二聚體有較強(qiáng)的靜電作用;而在拉鏈狀模型2中，配體二聚體中的R409取代了R415，同時E436和D429與受體二聚體之間的距離增加，導(dǎo)致配體二聚體與受體二聚體的作用減弱.重要的是，這兩個模型都一致性地顯示，靜電相互作用形成的鹽橋是拉鏈狀復(fù)合物形成的最主要的相互作用.另外，界面上的疏水相互作用對界面也有較大貢獻(xiàn)，特別是F373和I377的貢獻(xiàn)尤為顯著.這一結(jié)論與圖9中通過MD模擬計算出的F373-I377之間的RMSF普遍較小是一致的.圖中帶電的殘基和電勢的表面符號一般都比較匹配，特別是R388附近的負(fù)電勢很強(qiáng)，預(yù)示著這種拉鏈狀復(fù)合物之間的相互作用很強(qiáng)，這也可以解釋為什么化學(xué)趨向性受體在細(xì)胞膜上能克服讓細(xì)胞膜變形的彈性能障礙而形成拉鏈狀聚集.值得一提的是，R388也是倒金字塔形TOD形成的關(guān)鍵殘基之一，28因此拉鏈狀復(fù)合物和倒金字塔復(fù)合物相互競爭這些關(guān)鍵作用殘基.

圖10 拉鏈狀復(fù)合物的表面靜電勢與關(guān)鍵殘基Fig.10 Surface electrostatic potential and key residues of zipper like complexes

4 結(jié)論

化學(xué)趨向性受體在細(xì)胞膜上可以通過TOD為基本單元形成大規(guī)模聚集的團(tuán)簇，也可以通過尾部相互疊合形成拉鏈狀的聚集.為了研究拉鏈狀聚集的分子相互作用機(jī)制，我們以晶體結(jié)構(gòu)中的Tsr二聚體為基本單元，通過蛋白質(zhì)分子對接計算研究了二聚體形成的可能復(fù)合物結(jié)構(gòu).在對接所得到的復(fù)合物中，既能找到形成TOD的倒金字塔式復(fù)合物，也能找到形成拉鏈狀聚集的拉鏈狀復(fù)合物.由于沒有EM Map的數(shù)據(jù)，我們通過二聚體之間的角度和EM中測量出的平均尾部疊合長度數(shù)據(jù)從對接復(fù)合物中選擇拉鏈狀復(fù)合物模型.結(jié)果顯示Tsr二聚體的兩側(cè)各有一個界面可以通過尾部疊合的方式形成拉鏈狀復(fù)合物，并確認(rèn)兩個分別具有7.23和6.72 nm疊合長度的復(fù)合物為拉鏈狀復(fù)合物模型.對這兩個拉鏈狀復(fù)合物模型的MD模擬表明其是穩(wěn)定的.對界面的相互作用分析發(fā)現(xiàn)靜電和疏水相互作用是拉鏈狀復(fù)合物形成的主要原因.R388、F373和I377是最為關(guān)鍵的界面相互作用殘基.考慮到對應(yīng)EM實驗的EM Map數(shù)據(jù)尚未放出，由對接產(chǎn)生拉鏈狀復(fù)合物模型的坐標(biāo)是目前唯一可以得到的分子層次模型.在此基礎(chǔ)上，可以進(jìn)行進(jìn)一步的全原子或粗?；M.本文中研究的胞質(zhì)區(qū)二聚體片段含有264個殘基，對拉鏈狀聚集及二聚體的三聚體的聚集最好含有6個以上的二聚體(即能形成兩個以上的TOD)，超出了目前的數(shù)百殘基的全原子模擬范圍.29因此，對化學(xué)趨向性受體大規(guī)模聚集的模擬應(yīng)該基于本文提供的相互作用機(jī)制發(fā)展粗?；Ｐ?0并考慮使用耗散粒子動力學(xué)31，32等粗?；M中常用的介觀模擬技術(shù).本文的研究為化學(xué)趨向性受體的拉鏈狀聚集提供了分子相互作用的機(jī)制，也為進(jìn)一步的聚集理論或模擬提供了基礎(chǔ).

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