王新環(huán) 韓秋森 李婧影 楊 蓉，* 刁國旺 王 琛，*

(1揚州大學化學化工學院，江蘇揚州225002;2國家納米科學中心，納米生物效應(yīng)與安全性重點實驗室，北京100190)

1 引言

金納米顆粒因其特殊的光電性質(zhì)而被廣泛應(yīng)用于光電子學、生物標記、醫(yī)學檢測以及表面增強拉曼散射等領(lǐng)域.1近幾年來，在金納米材料的合成方面已取得很快的進展，人們已制備出多種形貌的金納米顆粒.2-4相比其它金納米材料，金納米棒具獨特且可調(diào)的表面等離子共振特性，在生物醫(yī)學應(yīng)用方面顯示出更為優(yōu)越的潛能.到目前為止，金納米棒的合成方法主要有模板法、光化學法、電化學法、晶種生長法.5-9由于前三種方法設(shè)備要求高、操作復(fù)雜、產(chǎn)量低，產(chǎn)量高的晶種生長法是目前金納米棒制備最常用的方法.但晶種法制備金納米棒時需要小于3 nm的金種子，加大了制備難度且耗時較長.在晶種法合成金棒的過程中，金種的濃度和大小對金棒的形狀和長度有很大的影響.10-12無種子法則是在抗壞血酸弱還原劑的還原作用下，直接加入微量的NaBH4，一步法快速制備金納米棒，更為直接、方便.

若將納米金棒應(yīng)用于生物醫(yī)學領(lǐng)域，還需要對其表面進行修飾.制備金納米棒的過程需要用到高濃度的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)分子，這會對細胞和生物體產(chǎn)生很高的毒性，13而且金納米棒表面吸附的CTAB雙分子層也影響金納米棒與生物分子的偶聯(lián)，14從而限制了金棒在生物醫(yī)學領(lǐng)域的應(yīng)用，所以在納米金棒表面進行修飾以消除CTAB的影響是至關(guān)重要的.13，15-17

隨著環(huán)境質(zhì)量的下降，惡性腫瘤的發(fā)病率越來越高.18，19熱療18，20-22是利用物理能量在腫瘤處組織中聚集產(chǎn)生熱效應(yīng)，使腫瘤處的組織溫度上升到有效的治療溫度(40-44°C)，使得腫瘤細胞的生長受阻與死亡的治療方法.生物組織和體液在700-900 nm的近紅外區(qū)域的光吸收和散射最少，光透過性的幾率很大，因而在近紅外區(qū)有吸收又能產(chǎn)熱的納米粒子被應(yīng)用到腫瘤熱療實驗中.越來越多的具有獨特光學性質(zhì)的納米材料，8，23-25如納米粒、26-28納米管、29納米球殼、30納米籠31-32以及納米棒33-34等被應(yīng)用到腫瘤治療的研究中.納米金棒在近紅外區(qū)有很強的吸收，且共振吸收峰位可調(diào)，在腫瘤熱療方面顯示出潛在的應(yīng)用前景.本文采用無種子法，以抗壞血酸(AA)和硼氫化鈉(NaBH4)為還原劑，CTAB為表面活性劑，在AgNO3穩(wěn)定劑下還原HAuCl4·3H2O，制備出納米金棒，并通過調(diào)節(jié)反應(yīng)物的含量研究了反應(yīng)物對金棒近紅外吸收峰位移的調(diào)控.我們用巰基聚乙二醇(PEG-SH)對納米金棒表面的CTAB分子進行了置換，細胞實驗驗證了修飾后的納米金棒的生物相容性明顯提高.利用納米金棒在近紅外光照射下發(fā)熱，研究其對腫瘤細胞的熱療效應(yīng).金棒的濃度和熱療時間都對光熱治療效果有一定的影響.

2 實驗部分

2.1 納米金棒的制備與表面修飾

實驗試劑和儀器:氯金酸(HAuCl4·3H2O，99.9%、十六烷基三甲基溴化銨(98%及抗壞血酸(AA，98%)，Alfa Aesar，美國;硝酸銀(AgNO3，分析純)、硼氫化鈉(NaBH4，分析純)，國藥集團化學試劑有限公司;巰基十一烷酸(MUDA，95%，百靈威試劑有限公司);巰基聚乙二醇(MW=5000，95%，北京鍵凱科技有限公司);臺式高速離心機(TG20M，長沙平凡儀器儀表有限公司);恒溫磁力攪拌器(RCT，IKa，德國).實驗中所有化學試劑均為分析純.

采用無種子法一步制備金納米棒，具體操作如下:溫度28-30 °C，取5 mL 0.2 mol·L-1的CTAB 加入到5 mL 1 mmol·L-1的HAuCl4·3H2O的水溶液中，攪拌中逐步加入300 μL 4 mmol·L-1AgNO3，用鹽酸調(diào)控溶液的pH值，然后加入70 μL 78.8 mmol·L-1的AA，溶液逐漸變?yōu)闊o色，停止攪拌;加入15 μL 0.01 mol·L-1的NaBH4，將溶液靜置.通過調(diào)控反應(yīng)中的AgNO3、鹽酸和NaBH4的量來調(diào)控納米金棒的尺寸和在近紅外處的吸收峰位置.反應(yīng)完成后離心去掉游離的CTAB，用水清洗3次，分散在水中.取1 mL金棒，加入100 μL酒精溶解的20 mmol·L-1的巰基十一烷酸，超聲2 h，離心去掉未反應(yīng)掉的巰基十一烷酸，重新分散在水中，得到羧基化聚乙二醇修飾的金棒;若要得到聚乙二醇修飾的金棒，則在反應(yīng)完成后離心去掉游離的CTAB的納米金棒溶液中加入200 μL 1 mmol·L-1的PEG-SH，搖床中反應(yīng) 24 h，離心后分散在水中.

2.2 納米金棒的表征

樣品的光學性質(zhì)通過紫外-可見-近紅外吸收光譜儀檢測(Lambda 950，美國Perkin Elmer Instruments).用透射電子顯微鏡(TEM，Tecnai G2 20 STWIN，美國FEI公司)和場發(fā)射掃描顯微鏡(FESEM，Hitachi S-4800，日本日立公司)觀察制備的金納米棒的形貌和尺寸.用電感耦合等離子光譜儀(ICP，iCAP Qc，美國Thermo Scientific)測定金元素的濃度.

2.3 A549細胞的培養(yǎng)及光熱治療實驗

將肺小細胞肺癌細胞(A549)置于37°C含5%CO2的飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)，用亞甲基雙丙烯酰胺(DMEM)高糖細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，以0.25%的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸鈉(EDTA)消化液消化細胞進行傳代培養(yǎng).按照細胞數(shù)將細胞配成一定濃度，在96孔培養(yǎng)板中每孔加100 μL溶液，使細胞數(shù)為8000/孔，置培養(yǎng)箱中24 h，分別加入不同濃度的CTAB-Au、MUDA-Au和聚乙二醇-金(PEG-Au)，每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔，陰性對照為加入細胞培養(yǎng)液，每組設(shè)3個復(fù)孔.在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，每孔加入10 μL 5 mg·mL-1的噻唑藍(MTT)，培養(yǎng)4 h后，吸出培養(yǎng)板中的液體，加入150 μL的二甲基亞砜(DMSO)，在酶標儀上測定490 nm處的光密度(OD)，然后進行數(shù)據(jù)處理.

按照上述方法同樣在96孔培養(yǎng)板中每孔加100 μL溶液，使細胞數(shù)為8000/孔，置培養(yǎng)箱中12 h，分別加入不同濃度的PEG-Au，每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔，陰性對照為加入細胞培養(yǎng)液.近紅外光(700-1100 nm)的光照時間分別為0、10、15、20 min，光照完成后繼續(xù)孵育24 h，檢測細胞存活率.熱療對細胞的影響則用多功能酶標儀(Tecnai infinite M200，TECAN)進行檢測.在熱療結(jié)束24 h后用50 μg·mL-1的染料吖啶橙(AO)染細胞后用Leica顯微鏡進行細胞數(shù)量和形貌的觀察.

3 結(jié)果與討論

3.1 金納米棒的形貌與近紅外區(qū)吸收的調(diào)控

3.1.1 金納米棒的形貌及吸收光譜

圖1為無種子法制備的納米金棒的形貌和吸收光譜.圖1A為場發(fā)射掃描電鏡(FESEM）圖片，從大范圍上看，金棒的分散性較好，且尺寸均勻.從TEM圖可看出產(chǎn)品形狀為棒狀，表面光滑，形貌均一，分散性較好.圖1B是納米金棒的可見-近紅外吸收光譜圖.可以看到樣品在530 nm處出現(xiàn)一個小的吸收峰，在900 nm左右產(chǎn)生一個強的吸收峰，處于近紅外區(qū)，在近紅外區(qū)有很強的吸收.

3.1.2 硝酸銀、鹽酸和硼氫化鈉濃度對納米金棒吸收峰的影響

通過改變實驗條件，可以調(diào)控納米金棒的紅外共振吸收峰位置.圖2(A，D)為AgNO3的濃度對納米金棒的影響.因為AgNO3傾向于沉積在金棒的(110)晶面，抑制了金離子的沉積，導(dǎo)致金的(100)晶面生長，生成金棒.14從圖2A中可以看出，隨著Ag+濃度的增加，縱向等離子共振吸收峰的最大吸收波長逐漸增加，金納米棒的長度逐漸增加，因金納米棒的直徑變化可以忽略，所以金納米棒的長徑比逐漸增加.在此同時，可以看到隨著Ag+濃度的增加，溶液的顏色逐漸變淺.實驗發(fā)現(xiàn)，如果無Ag+只能得到金納米顆粒.這是因為Ag+的單分子層與金棒的(110)晶面有很強的結(jié)合能，使得更多的金離子沉積在(100)晶面上，導(dǎo)致長徑比的增加.14

圖2(B，E)為鹽酸濃度對納米金棒的影響.從圖2B可以看出，隨著鹽酸的逐漸加入，縱向等離子共振吸收峰的最大吸收波長逐漸從800 nm左右藍移至700 nm左右，表明金納米棒的長度逐漸減少.從圖2E可見，隨著鹽酸的加入，溶液顏色逐漸變深，與金納米棒的長徑比減小相一致.鹽酸抑制了抗壞血酸的還原能力，增加了還原時間，導(dǎo)致還原后Au+更均勻地分布在金棒的(100)及(110)晶面上，使得長徑比降低.

圖2(C，F(xiàn))為NaBH4濃度對納米金棒的影響.相比種子法制備金納米棒，無種子法制備納米金棒的優(yōu)勢在于在形成金棒的溶液中直接加入微量的NaBH4，將Au+繼續(xù)還原為Au0，并在其它分子的共同作用下形成納米金棒.從圖2C可以看出，隨著NaBH4的逐漸加入，橫向等離子共振吸收峰略微減小，但縱向等離子共振吸收峰的最大吸收波長逐漸從700 nm左右紅移至850 nm左右.從圖2F可看到，隨著NaBH4的量加入的越多，溶液顏色越紅，同樣表明納米金棒的縱向等離子共振吸收峰逐漸紅移，紅顏色變亮.NaBH4取代了種子法制備納米金棒時金種子的作用將Au+直接還原成Au0，濃度越大，還原能力越強，加快了納米金棒成核和生長的過程.

圖1 (A)納米金棒的FESEM及TEM(插圖)圖;(B)納米金棒可見-近紅外吸收光譜圖Fig.1 (A)Field emission scanning electron microscopy(FESEM)and transmission electron microscope(TEM)(inset)images of Au nanorods;(B)visible and near infrared(Vis-NIR)absorption spectrum of Au nanorods

圖2 AgNO3(A，D)鹽酸(B，E)和硼氫化鈉(C，F(xiàn))的加入量對金棒的可見-紅外吸收峰位置的影響及溶液顏色變化圖Fig.2 (A)Vis-NIR spectra and color changes ofAu nanorods obtained at different amount ofAgNO3(A，D)，HCl(B，E)，and NaBH4(C，F(xiàn))

3.2 納米金棒的表面修飾

3.2.1 修飾MUDA和PEG-SH前后變化表征

圖3A是不同表面修飾的納米金棒溶液的可見-近紅外吸收光譜圖.從圖中我們可以看到，在修飾前CTAB穩(wěn)定的納米金棒在790 nm左右，經(jīng)PEGSH修飾的金棒的最強吸收波長基本在795 nm左右，峰型變窄，說明金棒的粒徑趨向于統(tǒng)一.圖3A中的TEM是剛合成的表面帶CTAB的納米金棒.圖3B是納米金棒的紅外光譜.我們可以看到在修飾完MUDA后，出現(xiàn)―COOH在1709 cm-1的特征吸收峰，說明MUDA成功修飾在金棒表面.PEG修飾的金棒出現(xiàn)了C―O鍵的特征吸收峰(1101 cm-1)，說明PEG也被成功地修飾在金棒表面.圖3(C，D)分別是MUDA分子和PEG修飾的納米金棒的TEM圖.很顯然，經(jīng)過PEG修飾后的金棒的分散性明顯提升.Li等35利用巰基聚酰胺-胺樹枝狀聚合物(PAMAM)通過形成Au―S鍵取代金棒上的CTAB，并利用PAMAM分子量和尺寸大小通過熱重變化和原子力顯微鏡)的粒子尺寸確認CTAB被取代.在本工作中，我們利用PEG-SH通過Au―S鍵對納米金棒表面的CTAB分子進行了置換.可見-近紅外吸收光譜也表明PEG被成功地修飾在金棒表面.

3.2.2 不同分子修飾的納米金棒的細胞生物相容性

本文研究了不同分子修飾的納米金棒對肺癌(A549)細胞生長的影響.從圖4可以看到，隨著納米金棒濃度的增加，不同分子修飾的金棒對細胞的生長有一定的影響.在金棒的濃度低于2.4 mg·L-1時，在三種分子修飾情況下，細胞的存活率仍在80%以上，但修飾了PEG的納米金棒對細胞的影響最小，存活的細胞最多.當金棒濃度繼續(xù)增大時，MUDA分子和PEG修飾的納米金棒對細胞的毒性增大，而和修飾了PEG的納米金棒共孵育的A549細胞的存活率仍很高.實驗結(jié)果顯示，PEG修飾的納米金棒有很好的細胞生物相容性.

3.3 納米金棒對腫瘤細胞A549的熱療效應(yīng)

從模擬細胞實驗的溫度變化圖上我們可以看出，溶液的溫度隨著金棒濃度的增加和照射時間的延長而逐漸升高.在金棒濃度為6 mg·L-1，照射時間為15 min時，溫度已經(jīng)升高了13°C.照射時間延長至20 min時，溫度升高17°C，達到殺死腫瘤細胞所需要的溫度.

圖3 表面修飾納米金棒的(A)可見-近紅外吸收光譜和(B)傅里葉紅外光譜;(C，D)分別為修飾巰基十一烷酸和聚乙二醇的金棒的TEM圖Fig.3 (A)Vis-NIR spectra and(B)Fourier transform infrared spectroscopy(FTIR)of surface functionalizedAu nanorods;(C，D)TEM images of MUDA-Au and PEG-Au nanorods，respectively

圖4 在不同濃度和不同表面修飾的納米金棒下A549細胞存活率Fig.4 A549 cell viability with different concentrations and different surface-functionalizedAu nanorods

因生物體的組織及體液對近紅外區(qū)的光吸收最少，近紅外區(qū)能透過皮膚進入組織內(nèi)部.而納米金棒在近紅外區(qū)有很強的吸收，吸收光能的金棒能發(fā)熱.如果能把金棒輸送到腫瘤部位，再用近紅外區(qū)的光進行激發(fā)使在腫瘤內(nèi)的納米金棒發(fā)熱，就有可能使腫瘤細胞產(chǎn)生損傷甚至死亡，進而達到治療目的.本文用PEG-SH修飾的納米金棒和腫瘤細胞A549共孵育，然后用近紅外光照射，觀察不同照射時間及不同金棒濃度對腫瘤細胞的殺傷效果.圖5A是熱療后細胞的熒光圖.當金棒的濃度為2 mg·L-1時，隨著熱療時間的增加，腫瘤細胞的數(shù)量有少許下降，但影響不大，沒有顯現(xiàn)出大的熱療效果.金棒濃度繼續(xù)增大到4 mg·L-1，照射時間為15 min時，細胞的數(shù)量已經(jīng)減少，照射20 min時細胞存活的數(shù)量已經(jīng)很少，說明熱療已經(jīng)起到明顯的作用.6 mg·L-1的金棒在熱療20 min時腫瘤細胞的存活數(shù)量已經(jīng)屈指可數(shù)，說明在所用的幾個金棒濃度中，6 mg·L-1的治療效果最明顯.

圖5C是對應(yīng)的MTT結(jié)果.從柱狀圖來看，黑色表示無納米金棒的細胞對照組.隨著近紅外光照射時間的增加，腫瘤細胞的存活率逐漸下降，但照射20 min時存活率依然很高，表明不加入金棒時，單純的光照對細胞生長的影響不大.但當加入金棒后，不同的金棒濃度在光照下對細胞的存活都有一定的影響.當金棒的濃度增大到4 mg·L-1時，在15 min近紅外光照射后，腫瘤細胞的存活率在70%以上，但當熱療時間為20 min時，腫瘤細胞的存活率急劇下降到20%左右，達到治療的目的.繼續(xù)增大金棒的濃度至6 mg·L-1時，光照20 min時細胞存活率急劇下降到20%以下.實驗結(jié)果表明單純的光照或金棒對腫瘤細胞的殺傷效果均不明顯，但在加入金棒達到一定濃度(6 mg·L-1)時，熱療時間增大到20 min，能使腫瘤細胞幾乎完全失去活性.

圖5 A549細胞在不同紅外光照時間和不同濃度PEG-SH(CPEG)修飾的納米金棒在光照下的升溫曲線(A)，熱療效果的熒光圖(標尺為75 μm)(B)及MTT結(jié)果(C)Fig.5 Temperature curves(A)，fluorescence images(scale bar is 75 μm)of hyperthermia effect(B)，and 3-(4，5-dimethyl-2-thiazoly)-2，5-diphenyl-2-H-tetrazo-lium bromide(MTT)results(C)of A549 cells at different NIR irradiation time with different concentrations(CPEG)of PEG-SH modified gold nanorods

4 結(jié)論

采用簡便快捷的無種子法成功制備了形貌均一的納米金棒.通過改變反應(yīng)物的濃度，研究了各反應(yīng)物對金棒近紅外區(qū)的吸收峰的影響，如改變AgNO3和NaBH4在反應(yīng)中加入的濃度，可以調(diào)節(jié)納米金棒的縱向等離子共振峰的位移.通過Au―S鍵將巰基聚乙二醇修飾在金棒表面，大大提高了納米金棒的細胞生物相容性.研究了在近紅外光照射下金棒對腫瘤細胞(A549)的光熱治療效應(yīng)，確定了最佳金棒濃度和熱療時間.實驗結(jié)果表明單純的光照或金棒對腫瘤細胞的殺傷效果均不明顯，但在加入金棒達到一定濃度，熱療時間增大到一定長度時能有很好的抑制腫瘤細胞活性的效果.我們的結(jié)果顯示納米金棒用于抗腫瘤治療有著潛在的應(yīng)用前景.

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