杜 威，江 萍，王彥蘇，呂立新，王宏偉，卜元卿，劉常宏，戴傳超,*

(1. 南京師范大學生命科學學院， 江蘇省微生物資源產(chǎn)業(yè)化工程技術研究中心，江蘇省微生物與功能基因組學重點實驗室，南京 210023； 2. 環(huán)境保護部南京環(huán)境科學研究所，南京 210042；3. 南京大學生命科學學院，南京 210093)

白僵菌是一種典型的殺昆蟲真菌，作為一種微生物農(nóng)藥在全世界廣泛使用[1]，白僵菌能夠寄生在多種昆蟲體內(nèi)并產(chǎn)孢[2]，它可以拮抗許多植物莖內(nèi)和葉際病原菌如灰霉病菌[3]、立枯絲核菌[4]等，除了能夠抑制病原菌菌絲生長，還能誘導多種病原菌的細胞裂解[5]。目前已經(jīng)報道白僵菌可以成為很多植物的內(nèi)生菌，例如其在可可豆[6]、咖啡幼苗[7]、玉米[8]中共生，也有研究表明其可以在一些樹種如西部白松[9]、椰棗[10]等樹中共生。

國內(nèi)外關于白僵菌的研究集中于其殺蟲機制以及與植物體的共生、拮抗病原菌等。對于其在土壤和葉際微生態(tài)系統(tǒng)中的行為研究較少，李永利等研究發(fā)現(xiàn)低溫、壤土及土壤含水量為15%的條件下有利于白僵菌的宿存[11]，王濱等研究了白僵菌在土壤中的宿存情況，發(fā)現(xiàn)前2個月內(nèi)處于波動狀態(tài)，隨后下降較快，但在宿存過程中產(chǎn)孢量不受影響[12]。但是在葉際微生態(tài)系統(tǒng)中白僵菌的殘留以及其對葉際微生態(tài)系統(tǒng)和植物本身的生理水平影響的研究幾乎沒有。在植物葉際生存的微生物稱為葉際微生物[13]，對葉際微生物的研究遠落后于根際微生物的研究[14]，而葉際微生物作為一類重要的群體具有固氮[15]，抵御病害[16]及改變宿主微環(huán)境等功能，對外界變化也較敏感，因此研究白僵菌施用后對植物葉際的微生物群落結(jié)構(gòu)、植物生理代謝水平影響及其在植物葉際的殘留動態(tài)對于評價微生物農(nóng)藥白僵菌的生物安全性有重要意義。

超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)等3種抗氧化酶類能夠有效的反映植物的生理代謝水平變化，可作為評價外界環(huán)境條件變化對植物生理代謝影響的指標。微生物群落結(jié)構(gòu)變化也可作為評價外界環(huán)境變化影響的指標。目前，廣泛利用分子生物學手段進行環(huán)境風險評價[17]，由于傳統(tǒng)涂布平板法的局限性，DGGE作為一種分子生物學手段能夠有效的反映環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化。

實時定量PCR 技術定量檢測環(huán)境中某種特定微生物的特異性和靈敏度都很高,目前已被作為一種成熟的技術手段用于微生物生態(tài)學研究[18- 20],選擇合適的靶序列將決定PCR檢測的特異性和靈敏度，從而精確的對某種特定微生物定量[21- 23]。本文獲得了1株有綠色熒光蛋白標記并能組成性表達的白僵菌菌株[24]，該基因是以整合到質(zhì)粒中的形式存在并轉(zhuǎn)化到白僵菌菌株中，在無篩選壓力下可以穩(wěn)定遺傳。針對綠色熒光蛋白序列設計了一對特異性引物,建立了快速定量檢測水稻葉際白僵菌殘留的實時定量PCR 方法。由于白僵菌和化學農(nóng)藥乙酰甲胺磷均對水稻害蟲二化螟有防治作用，因此本實驗在對水稻植株接種二化螟幼蟲的基礎上研究了不同濃度的白僵菌孢子懸液及化學農(nóng)藥對水稻葉際微生物區(qū)系及水稻保護酶系統(tǒng)的影響，評價白僵菌的生物安全性并在同一體系中比較生物農(nóng)藥和化學農(nóng)藥的生態(tài)影響，為白僵菌的使用提供指導和參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

(1)供試土壤 供試盆栽土壤取自南京師范大學植物園，土壤pH值5.97，有機質(zhì)1.08%，總氮1.21 g/kg，速效氮98.64 mg/kg，總磷0.39 g/kg，速效磷24.67 mg/kg，總鉀0.73 g/kg，速效鉀67.58 mg/kg。

(2)供試水稻(Oryzasativa) 水稻品種為武育粳D1，購于江蘇省農(nóng)業(yè)科學院。

(3)供試二化螟(Chilosuppressalis) 二化螟幼蟲由南京農(nóng)業(yè)大學高建芬副教授贈送。

(4)供試白僵菌(Beauveriabassiana) 白僵菌菌株Bb0062 (帶有草丁膦抗性標記基因bar和表達綠色熒光蛋白基因egfp)由西南農(nóng)業(yè)大學裴炎教授贈送；將GFP標記的白僵菌菌株進行擴繁處理，并進行熒光檢測，確定該白僵菌有很強的熒光活性。將平板上培養(yǎng)好的白僵菌刮取孢子并用無菌去離子水清洗并制成不同濃度孢子懸液用于實驗。

(5)供試化學農(nóng)藥 化學農(nóng)藥為乙酰甲胺磷，購于農(nóng)藥市場。

1.2 實驗設計

盆栽試驗地點在南京師范大學植物園。試驗共設7個處理，各6次重復。處理分別為CK (空白)、A (接種二化螟幼蟲)、B (1倍，即白僵菌施用濃度7.5×104孢子/mL)、C (10倍)、D (100倍)、E (1000倍)和F (化學農(nóng)藥)處理組(除空白處理組外均接水稻害蟲二化螟幼蟲)，白僵菌處理組每盆噴灑白僵菌孢子懸液40 mL，化學農(nóng)藥施用量按說明操作。試驗用桶高70 cm，桶口直徑30 cm，每桶放置過篩土20 kg。2012年5月1日育苗，待幼苗長至10—15 cm高時將其移秧至新桶中，每桶4穴。整個盆栽試驗期間，視土壤含水量狀況不定時灌澆自來水，定期拔除雜草。各處理組用3 m × 0.7 m × 1.5 m防蟲網(wǎng)遮蓋并用竹竿固定。于7月10日接種二化螟幼蟲并施用白僵菌孢子懸液和化學農(nóng)藥。

分別在噴施當天，噴施后第10、30天和第60天，帶無菌手套，采用打孔器采集水稻葉片，每個重復約5—6g葉片立即放入無菌樣品袋中并進行實驗。從同一處理的每個重復中各取1 g均勻混合并提取葉際總基因組，各重復的剩余部分去除葉脈后取0.5 g單獨進行酶活力的測定。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 白僵菌綠色熒光蛋白的引物設計

使用Primer 5.0設計引物(eGFP-F1/eGFP-R1)擴增標記白僵菌的綠色熒光蛋白的一段序列，PCR產(chǎn)物為289 bp。上下游引物序列分別是(eGFP-F1: 5′CAGTGCTTCAGCCGCTACCC3′, eGFP-R1: 5′AGT-TCACCTTGATGCCGTTCTT3′)。

1.3.2 實時定量PCR

實時定量PCR 擴增使用Step OneTM(ABI，USA)定量PCR 儀。熒光定量標準曲線使用梯度稀釋的白僵菌基因組DNA為模板。PCR 擴增反應為25 μL體系:2 μL DNA 模板,上下游引物各1 μL,10 μL SYBR PremixExTaq, ROX 0.4 μL,H2O 6 μL。擴增反應程序: 94℃預變性5 min；94℃ 30 s，60℃ 50 s，40 個循環(huán)。所有的熒光定量PCR反應條件和體系完全一致。

1.3.3 POD、SOD、CAT 3種酶活力測定

水稻葉片的POD、SOD、CAT 3種酶活力的測定使用南京建成公司試劑盒，其活性以每mg可溶性蛋白的催化活力U表示。

1.3.4 葉際微生物的分離及DNA提取

葉際微生物的分離方法參見文獻[25]，提取后的菌體沉淀使用Ultra CleanTMSoil DNA Isolation試劑盒(Mo BIO Laboratories) 提取DNA，然后用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.5 PCR 擴增和變性梯度凝膠電泳(DGGE)

DNA 的PCR 擴增條件見表1,反應體系均為50 μL體系：10×PCR 緩沖液5μL，MgCl23.5μL (20 mmol/L)，dNTP 2μL (10 mmol/L),上下游引物各1μL (10 μmol/L)，TaqDNA 聚合酶(REGEN BIOTEC公司)0.3 μL (1.5 U)，DNA模板1 μL (15 ng)，無菌超純水36 μL。PCR 產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠檢測。使用CBS-DGGE 電泳系統(tǒng)(CBS Scientific Co.)進行變性梯度凝膠電泳(DGGE)，聚丙烯酰胺凝膠濃度和變性梯度見表1，電泳緩沖液為1×TAE，PCR 產(chǎn)物上樣量為500 ng，60 ℃，100 V 電泳12 h，EB 染色20 min，UVP 凝膠影像分析系統(tǒng)拍照。

表1 PCR-DGGE條件

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗結(jié)果用算術平均數(shù)±標準誤表示，應用SPSS 13.0 軟件進行方差分析，(One-Way ANOVA) 檢驗處理間差異顯著性，并用Duncan 法進行多重比較，當P<0.05 時，各個處理間存在顯著差異。使用Excel 2007 進行作圖。

DGGE 指紋圖譜使用Gelcompar Ⅱ 軟件分析。其中，聚類分析使用UPGMA (unweighted pair-group method with arithmetic averages) 方法。用于計算群落生物多樣性的指標有：

(1) Shannon 指數(shù)H=-∑(ni/N) ln(ni/N)

式中,ni為單一條帶的峰面積；N為所有峰的總面積。

(2) 條帶數(shù)量S，為所在泳道的條帶總數(shù)目。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光定量PCR檢測白僵菌在水稻葉際的殘留

2.1.1白僵菌綠色熒光蛋白特異性引物設計及驗證

通過對白僵菌綠色熒光蛋白序列的擴增效果及特異性驗證篩選了一對合適的引物eGPF-F1 (5′-C AGTGCTTCAGCCGCTACCC - 3′)/eGFP-R1(5′-AGTTCACCTTGATGCCGTTCTT- 3′)。從圖1中可以看出，使用eGPF-F1/eGFP-R1進行常規(guī)PCR反應，可以得到單一的擴增條帶。

圖1 使用引物eGPF-F1/eGFP-R1擴增產(chǎn)物的電泳圖譜

2.1.2 白僵菌定量PCR標準曲線制備

熒光定量PCR擴增反應使用梯度稀釋的白僵菌基因組DNA做為模板，引物為eGPF-F1/eGFP-R1。圖2為白僵菌基因組熒光定量標準曲線，橫坐標(x)為模板質(zhì)量，縱坐標(y)為達到熒光閾值的循環(huán)數(shù)量即Ct值(y= -3.603x+28.351)。標準曲線的相關系數(shù)(R2>0.99)，這表明白僵菌基因組DNA質(zhì)量在10-1—103pg之間能夠很好地線性定量擴增。同時，將白僵菌基因組DNA繼續(xù)稀釋至10-2pg、10-3pg、10-4pg、10-5pg、10-6pg，用1 μL超純無菌水作對照進行擴增，研究該方法的檢測極限，1 fg/μL白僵菌基因組DNA為模板及1 μL超純無菌水代替DNA模板做為陰性對照均未能擴增，表明該體系的檢測下限為10 fg/μL白僵菌基因組DNA質(zhì)量，能夠滿足一般檢測需要。

圖2 白僵菌基因組實時定量PCR 標準曲線

2.1.3 水稻葉際白僵菌殘留量的跟蹤檢測

從CK、A、B、C、D、E、F總共7個處理中分別提取葉際總DNA，進行定量PCR。在所有的采樣時間點，CK、A、F處理中都沒有檢測到白僵菌的存在，說明在實驗處理中及后續(xù)時期白僵菌并未污染此3組處理，能夠更好的進行各處理組之間的比較。由圖3可以看出，在分別噴施1倍、10倍、100倍、1000倍白僵菌孢子懸液的B、C、D、E處理組中，在噴施后的第0、10、30天內(nèi)均檢測到了白僵菌的存在，而在第60天時4個處理組中均未檢測到白僵菌的存在，說明白僵菌可以在水稻葉片殘留至少達30 d之久。其中1000倍白僵菌處理即E處理組葉際白僵菌DNA含量在第0天為log102.93 (pg DNA/g葉片)，而在第30天時為log100.69 (pg DNA/g葉片)，衰減了99.42%，而D、C、B處理組的葉際白僵菌含量分別衰減了97.91%、92.41%、74.30%。說明了白僵菌噴施濃度越大，衰減速度越快，因此在噴施時應注意濃度不用過大，以免造成不必要浪費。

圖3 定量PCR研究水稻葉際白僵菌DNA 含量變化

2.2 白僵菌對水稻酶活力影響

2.2.1 白僵菌對水稻超氧化物歧化酶活力影響

超氧化物歧化酶SOD是目前為止發(fā)現(xiàn)唯一以超氧陰離子自由基為底物的酶，對于維護植物體內(nèi)動態(tài)平衡起著重要作用[26]，具有防御活性氧毒性等功效。由圖4可知，超氧化物歧化酶活性在整個周期中隨著時間的延長逐漸降低。白僵菌處理能提高水稻超氧化物歧化酶活性，其中以10—30 d效果最為明顯，在第10天時D處理組相比較CK提高了20.38%，而A處理組相比較CK略有下降，推測二化螟蟲害導致水稻酶活力下降，到成熟期，各處理組超氧化物歧化酶活力趨于一致。

圖4 不同處理對SOD活性的影響

2.2.2 白僵菌對水稻過氧化物酶活力影響

過氧化物酶主要起到酶促降解H2O2的作用，解除細胞內(nèi)有害自由基。由圖5可知，過氧化物酶活性在整個周期中呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，到第60天時達到最大值。白僵菌對過氧化物酶活力影響較小，在第10天時，F(xiàn)處理組水稻過氧化物酶活力較高，推測是由于植物的應激反應所導致。

圖5 不同處理對POD活性的影響

2.2.3 白僵菌對水稻過氧化氫酶活力影響

過氧化氫酶CAT可以分解H2O2形成O2和H2O，與植物代謝強度及抗逆能力密切相關[27]。由圖6可以看出，在整個周期內(nèi)隨著時間延長，過氧化氫酶活力逐漸下降。F和A處理組過氧化氫酶活力較低，推測病蟲害及化學農(nóng)藥均會降低過氧化氫酶活力，其中在第10天 時，A和F處理組相比較CK分別下降了19.55%和42.70%，化學農(nóng)藥處理導致酶活力下降幅度更大，在第30天 時4個白僵菌處理組過氧化氫酶活力均提高，其中C處理組相比較CK提高了33.67%，而在第60天 時，A處理組酶活力仍未恢復。

圖6 不同處理對CAT活性的影響

2.3 白僵菌對水稻葉際微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1 水稻葉際細菌DGGE分析

由圖7和表2可以看出，白僵菌對水稻葉際細菌群落結(jié)構(gòu)影響較小，但聚類分析表明在同一時期內(nèi)各處理組聚成一類，說明細菌群落結(jié)構(gòu)隨時間具有一定波動性，而同一時期內(nèi)各白僵菌處理組之間細菌群落結(jié)構(gòu)較相似，相比較其他處理組，條帶數(shù)及香農(nóng)指數(shù)有所提高。

圖7 水稻葉際細菌群落DGGE指紋圖譜聚類分析

2.3.2 水稻葉際真菌DGGE分析

由圖8和表3可知，真菌的群落結(jié)構(gòu)變化表現(xiàn)出與細菌相似的特點，即同一時期的各處理組聚成一簇，而白僵菌處理組群落結(jié)構(gòu)較類似，并且在后期條帶數(shù)及香農(nóng)指數(shù)相比較其他處理組有所提高。A處理組和F處理組條帶數(shù)及香農(nóng)指數(shù)均較小。

圖8 水稻葉際真菌群落DGGE指紋圖譜聚類分析

表2 葉際細菌群落多樣性

表3 葉際真菌群落多樣性

3 討論

雖然微生物農(nóng)藥白僵菌應用較廣泛，但國內(nèi)外目前尚沒有關于白僵菌對植物葉際影響的研究。本文首次對微生物農(nóng)藥白僵菌在葉際的生態(tài)影響做了較為全面的評價，并首次在同一系統(tǒng)中比較了生物農(nóng)藥白僵菌與化學農(nóng)藥對植物葉際的不同生態(tài)影響。

3.1 白僵菌在環(huán)境中的殘留

生防菌能否起到穩(wěn)定、持久的防病效果的重要因素就是其在植物根際能否有效定殖[28]。而研究生防菌在葉際的定殖對于評價其作用效果也至關重要。微生物農(nóng)藥在施用后面臨著衰減殘留情況的檢測問題，傳統(tǒng)抗生素標記及放射性同位素標記等技術手段難以直觀、準確區(qū)分土著微生物和人工接種微生物[29]，綠色熒光蛋白作為分子標記應用較廣，其對細胞無毒，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定[30]，但是熒光表達需要一定條件，在脅迫、寡營養(yǎng)階段或特殊生長階段也會出現(xiàn)熒光表達較弱的問題。本文建立了一種使用SYBR Green I 熒光染料快速檢測葉際白僵菌殘留的方法。SYBR Green I 的特異性主要依靠設計的PCR 引物的特異性。根據(jù)白僵菌綠色熒光蛋白序列設計了一對特異性引物eGFP-F1和eGFP-R1，驗證特異性、靈敏性均較高，結(jié)果表明白僵菌可以在水稻葉際殘留至少達30 d，本研究在試驗期間受多次的降水、大風的氣候因素的影響，推測白僵菌能夠與水稻由附生轉(zhuǎn)變?yōu)榘爰纳鸂顟B(tài)。殷幼平等研究發(fā)現(xiàn)綠色熒光蛋白標記的枯草芽孢桿菌在柑橘葉際定殖達42 d之久[31]，然而并未比較不同濃度的生防菌衰減速率，本文研究發(fā)現(xiàn)白僵菌初始噴施濃度越大，其在葉際的衰減速率越快，其中在第30天時B處理組白僵菌殘留量是初始量的25.70%，而E處理組白僵菌殘留量是初始量的0.58%。

3.2 白僵菌對水稻抗氧化酶活力研究

SOD、POD、CAT作為保護酶系統(tǒng)的主要指標，能夠反映植物的生理代謝水平。而目前國內(nèi)外針對植物保護酶系統(tǒng)的影響因素研究主要局限于化學農(nóng)藥[32]、重金屬離子[33- 34]、內(nèi)生菌[35]、鹽脅迫[36]、礦質(zhì)元素[37]等，關于微生物農(nóng)藥對植物保護酶系統(tǒng)的影響研究較少。本文研究發(fā)現(xiàn)白僵菌處理能夠提高水稻超氧化物歧化酶及過氧化氫酶活力，并且不同濃度白僵菌處理組之間酶活力相差較小，白僵菌能夠與植物互作，改善植物生長狀態(tài)，推測一方面白僵菌可以拮抗植物病原菌、誘導植物抗性[38- 39]及毒殺水稻害蟲二化螟，另一方面白僵菌可能影響水稻土壤從而間接改善植物生長條件，然而具體機制目前還不清楚。在A處理組即接種二化螟處理組中，3種保護酶活力均有不同程度下降，推測保護酶活力下降是由水稻蟲害導致的。在F處理組即化學農(nóng)藥處理能夠降低水稻過氧化氫酶活力，對其他兩種酶活力影響較小，推測是化學農(nóng)藥引起了植物的應激反應。

3.3 白僵菌對水稻葉際微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

總體來看，白僵菌處理并未造成葉際細菌群落較大波動。在真菌群落結(jié)構(gòu)中，A、F處理組條帶數(shù)及香農(nóng)指數(shù)均較小，說明水稻病蟲害及化學農(nóng)藥對真菌群落結(jié)構(gòu)有較大影響。在第10天時，化學農(nóng)藥處理后細菌及真菌多樣性均較小，這與荊夢[40]等研究結(jié)果是一致的，推測由于化學農(nóng)藥導致某些抗藥性菌群生長而抑制其他菌群的生長，從而導致葉際菌群結(jié)構(gòu)較單一。

4 結(jié)論

本文建立了定量檢測植物葉際白僵菌殘留的熒光PCR方法，結(jié)果表明靈敏性及特異性均較高，白僵菌可以在水稻葉際殘留達30 d之久，而白僵菌是以何種方式與水稻互作尚不清楚，同時白僵菌是否可以進入水稻葉片內(nèi)部甚至由葉片遷移到莖、根等部位也是值得研究的。另外本文研究了白僵菌對水稻保護酶活力的影響，而白僵菌是以何種機制提高水稻保護酶活力還有待闡明。最后，本文研究了白僵菌對水稻葉際的微生物群落結(jié)構(gòu)影響，DGGE聚類分析結(jié)果表明白僵菌處理后水稻葉際細菌、真菌的條帶數(shù)和香農(nóng)指數(shù)均有所升高說明白僵菌對水稻葉際微生物群落結(jié)構(gòu)有一定影響，而白僵菌作用于水稻后對水稻內(nèi)生菌的定殖是否影響也是值得研究的，只有闡明以上問題，才能更好的理解白僵菌的作用機制，更充分的評價微生物農(nóng)藥白僵菌的生物安全性。

致謝：西南大學生物技術中心裴炎教授提供綠色熒光蛋白標記的白僵菌菌種，南京農(nóng)業(yè)大學植物保護學院高建芬副教授提供二化螟幼蟲,特此致謝。

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