劉長建，劉 秋，姜 波，閆建芳，齊小輝

(大連民族學院生命科學學院，遼寧大連 116605)

苯乳酸(PLA)又稱3-苯基乳酸，或β-苯基乳酸即2-羥基-3-苯基丙酸。苯乳酸是繼乳酸菌產生的第一代抑菌物質如乳酸、醋酸和第二代抑菌物質如乳鏈菌素、片球菌素等細菌素以外的第三代天然抑菌物質。能抑制有害微生物的生長和發(fā)育，抑制有害微生物產生毒素，有效抵抗細菌和病毒的感染，進而提高機體的免疫力，保持機體健康狀態(tài)［1］。Dieuleveux發(fā)現，苯乳酸抑菌譜廣，對G+細菌、G-細菌和真核微生物均有抑制作用，這與Nisin等細菌素顯著不同。大部分細菌素只對與產生菌分類學上相近的細菌有作用，如Nisin抑制許多除乳酸菌以外的G+細菌，但對絕大部分G-細菌和酵母菌、霉菌沒有作用［2］。乳酸菌的某些屬種具有合成苯乳酸的能力，國外專利及文獻中已報道從不同生物來源特別是發(fā)酵食品中分離得到合成苯乳酸的乳酸菌菌株，如Lactobacillus plantalum 等［1，3-4］。

本實驗嘗試從發(fā)酵食品泡菜中分離出能產生苯乳酸的乳酸菌株，使其在食品、醫(yī)藥、化工等領域發(fā)揮新的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

發(fā)酵食品泡菜購自大連市場。

1.2 儀器及試劑

主要儀器包括液相色譜儀(日本島津);UV-2450分光光度計(日本島津);DNP-9052恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏);TC-512基因擴增儀(Techne)等。PCR反應所用的相關試劑均購于大連寶生物。其他試劑均為天津科密歐分析純產品。

1.3 培養(yǎng)基

分離用培養(yǎng)基:MRS培養(yǎng)基(Merck)和M17培養(yǎng)基(Oxoid)。

其他培養(yǎng)基:PY培養(yǎng)基、PYG培養(yǎng)基和含6.5%，18%NaCl的 MRS 培養(yǎng)基［5］;含苯丙氨酸(PPA)的液體培養(yǎng)基。

1.4 方法

1.4.1 乳酸菌的初步分離及純化

取1.0 g樣品加入9.0 mL無菌水室溫浸泡24 h。連續(xù)稀釋后取100 μL分別涂布于含碳酸鈣的2種分離固體培養(yǎng)基，37℃靜置培養(yǎng)24～48 h。挑取產生溶鈣圈的單菌落，轉接于對應的分離培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，純化2次。篩選過氧化氫酶陰性、革蘭氏陽性、HPLC法檢測產乳酸［6］的菌株進行下一步研究。

1.4.2 菌落形態(tài)、菌體細胞形態(tài)及生理生化特性

乳酸菌接種平板后，37℃恒溫培養(yǎng)，48 h后記錄菌落邊緣形狀、大小、顏色、與培養(yǎng)基的結合程度等菌落特征。同時高倍顯微觀察菌體革蘭氏染色、個體形狀、大小等細胞特征。分別測定菌株在10℃和45℃的生長情況、運動性、耐鹽性等生理生化特征［5］。

1.4.3 菌株的分子生物學鑒定

將純化得到的菌種在37℃條件培養(yǎng)2 d后，離心收集菌體，提取細菌總DNA。采用通用引物對其16S rDNA進行擴增，并進行測序后將序列輸入NCBI核酸數據庫中，與基因庫內所有核酸序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析［6］。

1.4.4 乳酸菌產苯乳酸試驗

將菌株以2%的接種量分別接種于含0.04%、0.08%、0.12%、0.16%、0.20%苯丙氨酸的MRS液體培養(yǎng)基，37℃靜置培養(yǎng)48 h。將菌株按2%的接種量接入含最適濃度苯丙氨酸的MRS液體培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)箱中分別靜置培養(yǎng) 24，36，48，60，72 h。發(fā)酵液離心后取上清，0.2 μm的膜過濾，高效液相色譜測定苯乳酸的含量［1，6］。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的篩選分離

根據菌落形態(tài)共篩選出12株疑似乳酸菌，轉接于對應的分離培養(yǎng)基中，純化2次。篩選過氧化氫酶陰性、革蘭氏陽性、發(fā)酵產乳酸［6］的、生長較好的2個菌株。

2.2 菌株的多相鑒定

2.2.1 菌落特征、細胞形態(tài)

2個菌株在MRS培養(yǎng)基上培養(yǎng)36 h后菌落均為乳白色，邊緣光滑、圓整、粘稠，直徑在0.3～0.5 mm。革蘭氏染色呈陽性，細胞短桿狀，細胞間呈短鏈或球狀排列(如圖1)。

圖1 菌株細胞形態(tài)的顯微觀察(×100)

2.2.2 耐鹽、耐溫特征

乳酸菌LMD在10℃和45℃均不生長，而LRA2在10℃不能生長，但能耐受 45℃;在6.5%NaCl時2個菌株都能生長，而菌株LRA2在NaCl質量體積達到18%時不能生長(見表1)。

表1 菌株生長特性

2.2.3 16S rDNA序列分析

以菌株LMD、LRA2總的DNA為模板，擴增獲得了2條特異的擴增條帶，長度分別為1387 bp和1090 bp。將序列提交到GenBank獲得登錄號分別為KC108666和KC108667。通過Blast程序與GenBank核酸序列庫中的序列進行比對，發(fā)現LMD和LRA2與多株腸膜明串珠菌的相似性都超過99%。明串珠菌屬共13個種［7］的eztaxon網站的16S rRNA序列，與菌株LMD和LRA2進行聚類分析(如圖2)，菌株 LMD和 LRA2與 Leuconostoc mesenteroides的3個亞種在同一分支上。因此可以確定菌株LMD和LRA2屬于明串珠菌屬中的腸膜明串珠菌(L.mesenteroides)。圖2中分支上的數值為自舉1 000次的結果，當數值≥51%時顯示。

圖2 菌株LMD、LRA2和參比明串珠菌屬菌株的16S rDNA同源性的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 乳酸菌產苯乳酸能力

乳酸菌LMD和LRA2皆能產苯乳酸，且產量隨著培養(yǎng)基中PPA質量濃度上升而變大(如圖3)。當培養(yǎng)基中PPA達到0.16%時，菌株的苯乳酸產量增加趨勢變緩;當到達0.2%時，菌株LMD苯乳酸產量達0.132 2 mg·mL-1，菌株LRA2 產量達 0.124 5 mg·mL-1。

圖3 培養(yǎng)基中苯丙氨酸含量對菌株產苯乳酸量的影響

當培養(yǎng)基中含0.16%PPA時，菌株的苯乳酸產量隨時間增加而增加(如圖4)。前48 h，菌株LMD和LRA2的苯乳酸產量增加緩慢;而在48～60 h，菌株LMD和LRA2的苯乳酸產量增加趨勢最快。當培養(yǎng)72 h時，菌株產苯乳酸含量最高，LMD和LRA2的苯乳酸產量分別達0.144 7 mg·mL-1和 0.158 5 mg·mL-1。

圖4 培養(yǎng)時間對菌株產苯乳酸量的影響

3 結論與討論

乳酸菌在自然界分布廣泛，實驗從泡菜中初步分離得到過氧化氫酶陰性、革蘭氏陽性、發(fā)酵液產乳酸的乳酸菌12株，通過溫度、高鹽試驗篩選到2株乳酸菌LMD和LRA2。根據菌落、細胞形態(tài)、生理生化特性以及16S rDNA序列比對，可鑒定LMD和LRA2為腸膜明串珠菌。采取在培養(yǎng)基中添加苯丙氨酸的方法，利用HPLC法測定乳酸菌發(fā)酵液中苯乳酸的產量，菌株LMD和LRA2均能利用苯丙氨酸產苯乳酸。苯乳酸的產量與培養(yǎng)基中苯丙氨酸的添加量呈正相關;當苯丙氨酸的添加量為0.16%時，苯乳酸的產量與培養(yǎng)時間呈正比，在48～60 h產量增加最快;在72 h時，LMD的苯乳酸產量為0.144 7 mg·mL-1，LRA2的苯乳酸產量為0.158 5 mg·mL-1。

已經有 Lactobacillus、Weissella、Enterococcus、Leuconostoc等多個屬的細菌能產苯乳酸的報道［1，3，4，8，9］，如李興峰［1］等分離的 112 株乳酸菌中有70株的苯乳酸產量在0.0166～0.0914 mg·mL-1。但目前明串珠菌屬的報道不多，只有Valerio［8］等從橄欖葉中分離的Leuconostoc mesenteroides subsp.mesenteroides ITMY30能產生0.094 6 mg·mL-1苯乳酸，低于本研究分離的Leuconostoc mesenteroides LMD和LRA2的苯乳酸產量。本研究和其他研究表明，苯乳酸可能是乳酸菌的普遍代謝產物，個體差異大，其產量取決于菌株個體［1，8］。目前看來短期內苯乳酸不能完全取代化學防腐劑和抗生素，但從長遠觀點看，隨著科學技術的發(fā)展，本實驗篩選出的高產苯乳酸菌株可作為菌株資源進行深入的研究。

［1］LI Xingfeng，JIANG Bo，PAN Beilei.Biotransformation of phenylpyruvic acid to phenyllactic acid by growing and resting cells of a Lactobacillus sp［J］.Biotechnol Lett，2007，29(4):593-597.

［2］ DIEULEVEUX V，LEMARINIER S，GUEGUEN M.Antimicrobial spectrum and target site of D-3-phenyllactic acid［J］.Int J Food Microbiol，1998，40:177-183.

［3］VERMEULEN N，GANZLE M G，VOGEL R F.Influence of peptide supply and cosubstrates on phenylalanine metabolism of Lactobacillus sanfranciscensis DSM20451T and Lactobacillus plantarum TMW1.468［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2006，54(11):3832-3839.

［4］COLORETTI F，CARRI S，ARMAFORTE E，et al.Antifungal activity of lactobacilli isolated from salami［J］.FEMS Microbiology Letters，2007，271(2):245-250.

［5］凌代文.乳酸菌分類鑒定及實驗方法［M］.北京:中國輕工業(yè)出版社，1998.

［6］劉長建，閆建芳，劉秋，等.豬消化道中產苯乳酸乳酸菌的益生特性研究［J］.微生物學通報，2012，39(6):804-810.

［7］EUZEBY J P.List of bacterial names with standing in nomenclature:a folder available on the internet［J］.Int J Syst Bacteriol，1997，47(2):590-592.

［8］VALERIO F，LAVERMICOCCA P，PASCALE M，et al.Production of phenyllactic acid by lactic acid bacteria:an approach to the selection of strains contributing to food quality and preservation［J］.FEMS Microbiology Letters，2004，233(2):289-295.

［9］劉戈，王立梅.Lactobacillus paracasei W2合成苯乳酸培養(yǎng)條件的優(yōu)化［J］.食品科學，2010，31(23):174-177.