董玉瑛，趙穎慧，鄒學(xué)軍，崔玉波，George Zhang

(1.大連民族學(xué)院環(huán)境與資源學(xué)院，遼寧大連116605;2.美國康寧公司生命科學(xué)部藥物相互作用研究中心)

鹽酸環(huán)丙沙星是第三代喹諾酮類藥物，其分子式為 C17H18FN3O3·HCl·H2O，分子量為385.82，是氟喹諾酮類藥物中抗菌活性強(qiáng)的品種，可直接作用于細(xì)菌的細(xì)胞核，抑制細(xì)菌的DNA旋轉(zhuǎn)酶，導(dǎo)致細(xì)菌快速死亡，因而被廣泛應(yīng)用于漁業(yè)生產(chǎn)中以防治水生動(dòng)物的各種傳染性疾?。?］。研究表明，鹽酸環(huán)丙沙星具有較嚴(yán)重的肝腎毒性，攝入量較多時(shí)會(huì)造成人體內(nèi)臟損傷、消化系統(tǒng)出血、肝腎功能異常炎癥及衰竭、血液系統(tǒng)白血球減少等癥，神經(jīng)系統(tǒng)的疾病和過敏癥也有發(fā)生［2-3］。這些施于水體的藥物不僅作用于靶生物以防治病害，而且對(duì)非靶生物也產(chǎn)生影響和毒害，從而導(dǎo)致水體微生態(tài)失衡以及生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)、功能的破壞［4］。目前，關(guān)于鹽酸環(huán)丙沙星對(duì)不同食物鏈水生生物的急性毒性以及對(duì)水生生態(tài)環(huán)境的潛在風(fēng)險(xiǎn)尚未有明確清晰的分析。

發(fā)光菌、小球藻、大型蚤和孔雀魚分別是自然水體中單細(xì)胞生物、浮游植物、浮游動(dòng)物和魚類四個(gè)營養(yǎng)級(jí)上的代表生物，也是目前水生生物毒理學(xué)研究的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試生物。本研究通過分析鹽酸環(huán)丙沙星對(duì)發(fā)光菌、小球藻、大型蚤和孔雀魚的急性毒性，獲得對(duì)不同食物鏈生物影響的預(yù)測(cè)無效應(yīng)濃度，結(jié)合大連開發(fā)區(qū)的人口消費(fèi)、醫(yī)藥生產(chǎn)企業(yè)、污水處理工藝等情況，評(píng)價(jià)鹽酸環(huán)丙沙星在大連灣水域中的風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)。

1 材料與方法

1.1 水源

大連開發(fā)區(qū)污水處理廠排水口出水;大連灣養(yǎng)殖區(qū)水域。

1.2 儀器及試劑

儀器:DXY-2型生物毒性測(cè)試儀(中國科學(xué)院南京土壤研究所);85-2型恒溫磁力攪拌器(上海司樂儀器廠);THZ-82氣浴恒溫振蕩器(江蘇金壇儀器廠);DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司);LDZX-40CI型立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠);BS214D型電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);不同量程的精密移液器(Thermo公司，美國);SJH型潔凈工作臺(tái)(沈陽市凈化儀器廠二分廠)等。

主要試劑:鹽酸環(huán)丙沙星片(哈藥集團(tuán)制藥總廠);明亮發(fā)光桿菌(Photobacterium phosphoreum)凍干粉(中國科學(xué)院南京土壤研究所微生物室)。發(fā)光菌凍干粉劑的復(fù)蘇、斜面菌種的培養(yǎng)、搖瓶菌液的培養(yǎng)、工作菌液的制備等過程見文獻(xiàn)［5］。

1.3 發(fā)光菌毒性實(shí)驗(yàn)方法

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果，將鹽酸環(huán)丙沙星溶液用3%NaCl溶液稀釋配制成10～15個(gè)濃度梯度，各取4.5 mL加入具塞磨口比色管，以4.5 mL 3%NaCl溶液作空白對(duì)照，每個(gè)濃度梯度設(shè)3組平行對(duì)照。將培養(yǎng)好的工作菌液取0.5 mL于各比色管中(控制空白對(duì)照管發(fā)光強(qiáng)度300～900 mV范圍內(nèi))，加塞充分振蕩，去塞，暴露15 min，用生物毒性測(cè)試儀測(cè)定暴露于不同濃度梯度鹽酸環(huán)丙沙星溶液中發(fā)光菌的發(fā)光強(qiáng)度。

對(duì)其他食物鏈生物的毒性數(shù)據(jù)源自文獻(xiàn)［4，6］。

1.4 預(yù)測(cè)無效應(yīng)濃度(PNEC)的估算方法

應(yīng)用基于生物毒性實(shí)驗(yàn)的PNEC經(jīng)驗(yàn)估算方法［7-8］，表達(dá)式如下:

式中，評(píng)價(jià)因子分別為1 000(對(duì)單純營養(yǎng)級(jí)進(jìn)行單次急性實(shí)驗(yàn));100(對(duì)不同的營養(yǎng)級(jí)進(jìn)行3次急性實(shí)驗(yàn));10(進(jìn)行慢性實(shí)驗(yàn))［9］。

1.5 預(yù)測(cè)環(huán)境濃度(PEC)的估算方法

藥物評(píng)價(jià)與遷移評(píng)估模型(Pharmaceutical Assessment and Transport Evaluation，簡稱 PhATETM)基于質(zhì)量守恒方法建模進(jìn)行水環(huán)境中APIs的濃度估算［10］。若不考慮大連經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)污水處理廠的排水經(jīng)過其他河流的遷移稀釋情況，則默認(rèn)為直接排入海中。估算PEC簡易PhATETM模型描述如下:

式中，A(kg·a-1)為鹽酸環(huán)丙沙星年均排放量，R(%)為污水處理廠的去除率，P(人)為污水處理廠的服務(wù)人口，V(m3·d-1)為日人均廢水排放量，D為稀釋因子(無量綱)，PEC 單位為 g·L-1［9］。

1.6 環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)甄別方法

對(duì)于環(huán)境生態(tài)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，通過環(huán)境暴露濃度與效應(yīng)濃度的比值，可以確定化學(xué)物質(zhì)對(duì)生態(tài)環(huán)境的風(fēng)險(xiǎn)商(Risk Quotient，RQ)。商值法數(shù)學(xué)表達(dá)式為RQ=PEC/PNEC［11］。當(dāng)風(fēng)險(xiǎn)商值 RQ為0.1～1.0時(shí)，表明需對(duì)生態(tài)環(huán)境進(jìn)行觀察;當(dāng)RQ在1.0以上時(shí)需采取相應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)削減措施。

2 結(jié)果與討論

2.1 對(duì)發(fā)光菌發(fā)光強(qiáng)度的抑制作用

測(cè)定鹽酸環(huán)丙沙星對(duì)發(fā)光菌的毒性效應(yīng)，其測(cè)試曲線如圖1。

圖1 鹽酸環(huán)丙沙星對(duì)發(fā)光細(xì)菌的毒性影響

從圖1中可以觀察到，鹽酸環(huán)丙沙星對(duì)發(fā)光菌發(fā)光強(qiáng)度的抑制曲線整體呈現(xiàn)單調(diào)非線性遞增趨勢(shì)，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到40 mg·L-1時(shí)，鹽酸環(huán)丙沙星對(duì)發(fā)光菌發(fā)光強(qiáng)度的相對(duì)抑制率大于20%;當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到75 mg·L-1時(shí)，其相對(duì)抑制率接近80%。因此，鹽酸環(huán)丙沙星對(duì)發(fā)光菌發(fā)光強(qiáng)度影響的突躍范圍為40～75 mg·L-1。通過效應(yīng)濃度相關(guān)分析得知，其EC50值為63.27 mg·L-1。

2.2 對(duì)不同食物鏈水生生物的急性毒性分析

鹽酸環(huán)丙沙星對(duì)小球藻、發(fā)光菌、大型蚤和孔雀魚的毒性數(shù)據(jù)匯總見表1。由表1可知，其急性毒性 EC50或者 LC50數(shù)值分別為 20.61，63.27，135.15，365.00 mg·L-1。毒性作用規(guī)律結(jié)果顯示，隨著生物鏈等級(jí)的升高，生物對(duì)環(huán)丙沙星的耐受程度升高。

表1 鹽酸環(huán)丙沙星對(duì)水生生物的急性毒性作用

2.3 PNEC的估算

結(jié)合 Cunningham V.L.［7］和 Marie P.H.［8］課題組的研究成果，基于生物毒性實(shí)驗(yàn)的PNEC簡易估算方法，若對(duì)每種生物進(jìn)行單一急性實(shí)驗(yàn)時(shí)，則評(píng)價(jià)因子取1 000。結(jié)合急性毒性測(cè)定結(jié)果，由方程(1)計(jì)算不同水生物的PNEC值，所得結(jié)果見表1。

2.4 PEC的估算

簡易的PhATETM模型可對(duì)河流中鹽酸環(huán)丙沙星進(jìn)行環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)，能夠較好地預(yù)測(cè)醫(yī)藥品暴露的PEC值。應(yīng)用該模型需要獲得化合物的特性參數(shù)和地域參數(shù)，包括藥品的年銷售量和藥品在不同過程的去除率等信息。由于鹽酸環(huán)丙沙星被大量應(yīng)用于漁業(yè)養(yǎng)殖中，其在魚體內(nèi)的代謝速度較慢，富集后殘留在魚體有一個(gè)較長的過程(對(duì)生物體的危害是通過藥物在魚體的殘留)，又經(jīng)過食物鏈進(jìn)入人體，因此，考慮鹽酸環(huán)丙沙星是作為獸藥大量進(jìn)入水體，本研究中應(yīng)用方程(2)分別計(jì)算污水處理后入?？谝约敖０娥B(yǎng)殖區(qū)海水水質(zhì)中鹽酸環(huán)丙沙星的風(fēng)險(xiǎn)。

截至2012年底，大連經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)戶籍人口統(tǒng)計(jì)約35萬人，流動(dòng)人口近5萬人，即區(qū)域服務(wù)人口總數(shù)為40萬，家畜年養(yǎng)殖量視為定值。開發(fā)區(qū)污水處理一廠和開發(fā)區(qū)排水公司污水處理二廠共同承擔(dān)著全區(qū)污水處理工作。處理一廠日處理污水量為10萬m3;處理二廠日處理污水量為8萬m3，污水處理后排海(即日處理污水總量為18萬m3·d-1)。大連經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)污水處理廠的出水未經(jīng)過河流的遷移稀釋而直接排入海中，不考慮河流遷移的稀釋作用，故簡易PhATETM模型中的稀釋因子取1。區(qū)內(nèi)沒有生產(chǎn)鹽酸環(huán)丙沙星片的制藥廠，因此，不考慮藥物制備車間的處理廢水這一項(xiàng)。根據(jù)對(duì)全區(qū)的分析，未經(jīng)污水處理廠而直接排放的廢水和對(duì)未使用的藥品進(jìn)行不合理處置進(jìn)入環(huán)境的藥品量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于病人的直接排放量，因而不納入本研究的模型因子中。根據(jù)Golet等［12-13］的研究，污水處理廠普遍采用微生物厭氧和耗氧處理技術(shù)對(duì)常見醫(yī)藥品的均處理效率R為83%。在漁業(yè)養(yǎng)殖過程中，以大連灣海域大連灣口以北海區(qū)養(yǎng)殖面積與養(yǎng)殖深度的乘積為總體積(養(yǎng)殖面積約13.3×106m2，養(yǎng)殖深度大約在20 m之內(nèi))。將上述有關(guān)數(shù)據(jù)代入方程(2)中，計(jì)算獲得的PEC結(jié)果見表2。

表2 簡易PhATETM模型估算鹽酸環(huán)丙沙星的PEC

2.5 環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)分析

根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)的原理，風(fēng)險(xiǎn)是毒性效應(yīng)和暴露水平的函數(shù)，即暴露在環(huán)境中的有毒物質(zhì)達(dá)到一定水平時(shí)才能產(chǎn)生風(fēng)險(xiǎn)。在這里，毒性效應(yīng)PNEC是可能對(duì)生物和生態(tài)系統(tǒng)造成潛在影響的估測(cè)濃度，表征物質(zhì)產(chǎn)生風(fēng)險(xiǎn)的可能性;暴露濃度PEC是綜合了化合物分子的物理、化學(xué)、生物特性以及污水和地表水流量的水文信息而得到的濃度數(shù)據(jù)，表征物質(zhì)產(chǎn)生風(fēng)險(xiǎn)的現(xiàn)實(shí)性［14］。基于藥品風(fēng)險(xiǎn)管理的設(shè)計(jì)思路，計(jì)算鹽酸環(huán)丙沙星的綜合評(píng)價(jià)因子PEC/PNEC的比值，結(jié)果見表3。

表3 鹽酸環(huán)丙沙星的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)綜合評(píng)價(jià)

根據(jù)計(jì)算出的綜合評(píng)價(jià)因子的范圍值，對(duì)大連開發(fā)區(qū)污水處理廠排水的檢測(cè)可以看出，評(píng)價(jià)因子的數(shù)值以小球藻最高，已達(dá)到6.102～7.291，小球藻可以作為評(píng)價(jià)水體中鹽酸環(huán)丙沙星殘留風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)的生物標(biāo)志物。

3 結(jié)論

(1)本實(shí)驗(yàn)通過發(fā)光菌的毒性實(shí)驗(yàn)，得到其EC50值為 63.27 mg·L-1，與文獻(xiàn)［4，6］所得小球藻、大型蚤、孔雀魚的EC50或者LC50數(shù)值進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)隨著生物等級(jí)升高，不同食物鏈?zhǔn)茉嚿锒拘詳?shù)值升高，即表明對(duì)外來污染物的耐受程度升高。

(2)將綜合評(píng)價(jià)因子(PEC/PNEC)作為環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)表征參數(shù)，應(yīng)用PEC和PNEC的估算模型，采用不同食物鏈水生生物對(duì)大連開發(fā)區(qū)污水處理廠排水及大連灣沿海養(yǎng)殖區(qū)中鹽酸環(huán)丙沙星的含量進(jìn)行環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)分析，發(fā)現(xiàn)小球藻的風(fēng)險(xiǎn)商數(shù)值達(dá)到6.102～7.291，可作為評(píng)價(jià)水體中鹽酸環(huán)丙沙星殘留風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)的生物標(biāo)志物。

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