鄭芳霞,李學章,鄭衛(wèi)霞,程玉峰Δ,盛延興,高雯

(1.山東大學齊魯醫(yī)院 放療科,山東 濟南 250012;2.山東省聊城市人民醫(yī)院 放療科,山東 聊城 252000;3.南京醫(yī)科大學 臨床醫(yī)學系,江蘇 南京 210029)

CD137L在非小細胞肺癌增殖、遷移、侵襲中的作用及機制

鄭芳霞1,李學章2,鄭衛(wèi)霞2,程玉峰1Δ,盛延興2,高雯3

(1.山東大學齊魯醫(yī)院 放療科,山東 濟南 250012;2.山東省聊城市人民醫(yī)院 放療科,山東 聊城 252000;3.南京醫(yī)科大學 臨床醫(yī)學系,江蘇 南京 210029)

目的 研究CD137L在非小細胞肺癌中的表達，及其對細胞增殖、遷移和侵襲的影響，探討其可能的分子生物學機制。方法 通過體外構建CD137L高表達慢病毒載體［A549-TC-1（+)］及CD137L-RNA干涉慢病毒載體［A549-TC-1（-)］和空白載體（A549-control)，分別轉(zhuǎn)染肺癌A549細胞。采用Western blot檢測3組細胞CD137L蛋白的表達；MTT法檢測細胞增殖情況；Matrigel transwell小室侵襲實驗研究肺癌細胞侵襲能力；ELISA方法檢測細胞上清IL-6和IL-8的水平。結(jié)果 Western blot結(jié)果顯示:與A549細胞相比，CD137L蛋白在A549-TC-1（+)細胞中表達明顯增多，A549-TC-1（-)細胞中表達明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05)，在轉(zhuǎn)染A549-control中無明顯變化，表明3種病毒載體可用于后續(xù)實驗。MTT細胞增殖實驗及Matrigel Transwell小室侵襲實驗結(jié)果顯示:與A549-control相比，A549-TC-1（+)細胞增殖、遷移及侵襲能力均明顯增強，A549-TC-1（-)細胞增殖、遷移及侵襲能力均明顯減弱，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05)。ELISA檢測結(jié)果顯示:A549-TC-1（+)細胞中細胞因子 IL-6、IL-8的水平明顯高于A549-TC-1（-)細胞組和正常A549細胞組。結(jié)論 CD137L對非小細胞癌細胞的增殖、侵襲具有正性調(diào)節(jié)功能，其作用機制可能與促進IL-6、IL-8的分泌進而增強腫瘤的生長、增殖和侵襲能力有關。

CD137L；非小細胞癌；增殖；遷移；侵襲

非小細胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)是肺癌的主要類型,未發(fā)生轉(zhuǎn)移的肺癌患者其5年生存率達50%,而局部浸潤或區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者只有約20%,遠處轉(zhuǎn)移的患者其5年生存率僅為4%,可見侵襲和轉(zhuǎn)移是造成非小細胞肺癌患者療效差和死亡的主要原因［1-2］。CD137L及其受體CD137是一對重要的共刺激分子,在抗腫瘤免疫中起著重要的作用。主要表達于活化的T淋巴細胞和NK細胞,參與T細胞的活化,細胞因子的分泌以及調(diào)控單核細胞的增殖和分化等［3-4］。近年發(fā)現(xiàn)CD137L在多種腫瘤細胞株及人體腫瘤組織細胞有組成型表達,并對腫瘤細胞的生物學行為產(chǎn)生一定影響［5-6］。為進一步明確CD137L對非小細胞肺癌生物學行為影響的具體機制,本研究旨在通過體外構建CD137L高表達慢病毒載體及CD137L-RNA干涉慢病毒載體轉(zhuǎn)染肺癌A549細胞,探討CD137L對非小細胞肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子生物學機制,為臨床治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 人肺腺癌細胞系A549細胞源自中國腫瘤細胞庫;CD137L高表達慢病毒、CD137L-siRNA慢病毒、空白載體慢病毒由上海生博生物醫(yī)藥科技有限公司構建。BCA蛋白定量試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司。兔抗人CD137L抗體購自美國Santa Cruz公司;兔抗人β-actin抗體購自北京博奧森生物技術有限公司;麗春紅S購自德國Serva公司;考馬斯亮藍購自美國Sigma公司;新生牛血清購自中國四季青公司;RPMI 1640購自美國 Gibco公司;IL-6、IL-8酶聯(lián)吸附檢測試劑盒,購自上海綠葉生物技術有限公司。玻片架購自北京華越生物科技有限公司;染色缸購自北京華越生物科技有限公司;恒溫烤箱購自吳江遠順烘箱設備有限公司;孵育盒購自北京華越生物科技有限公司;倒置光學顯微鏡購自日本OLYMPUS公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng):A549細胞用含10%新生血清及雙抗(青霉素、鏈霉素各100 U/mL)的RPMI 1640培養(yǎng)液常規(guī)貼壁培養(yǎng),置于5%CO2、37℃、濕度為95%培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。選擇第三代對數(shù)生長期的A549細胞,計數(shù)按2×103每孔接種于無菌24孔培養(yǎng)板中,繼續(xù)培養(yǎng)12 h,用于后期實驗。選取24孔板中1孔細胞計數(shù),估算每孔中 A549細胞數(shù)量,根據(jù)細胞感染復數(shù)(multiplicity of infection,MOI)=50分別在含10%FBS及雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)液中添加制備的3種病毒,置于5%CO2、37℃培養(yǎng)12 h。用無菌PBS震蕩清洗細胞3min×3次,換用常規(guī)培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。采用有限稀釋法篩選轉(zhuǎn)染細胞,將轉(zhuǎn)染CD137L高表達病毒、CD137L-siRNA慢病毒及空白載體慢病毒的細胞分別命名為A549-CD137L(+)、A549-CD137L(-)、A549-control。

1.2.2 Western blot檢測細胞CD137L蛋白表達:選取對數(shù)生長期的A549-CD137L(+),A549-CD137L(-),A549-control及對照組細胞,PBS洗滌3遍,細胞計數(shù)并離心,每1×107個細胞加入150μL RIPA Buffer,4℃裂解60 min,4℃離心20min,收集上清。利用BCA蛋白定量試劑盒對蛋白進行定量。用SDS凝膠電泳將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉1 h;TBST反復洗膜3次,每次5 min。加入一抗(CD137L,1∶500;β-actin,1∶2 000,TBST稀釋)浸透PVDF膜,4℃過夜,次日復溫1 h;TBST洗膜3次,加入二抗(羊抗兔 IgG-HRP,1:5000,TBST稀釋),室溫孵育2 h,TBST洗膜3次;利用低背景化學發(fā)光檢測試劑盒成像系統(tǒng)采集圖像。以β-actin內(nèi)參照條帶作為參照,分析目的條帶的代表的蛋白表達水平［7］。

1.2.3 MTT細胞增殖實驗:取對數(shù)生長期的A549-CD137L(+),A549-CD137L(-),A549-control細胞,計數(shù)后各取1×107個細胞,按照4×103個細胞/孔轉(zhuǎn)至無菌96孔板,每種細胞鋪8孔,共鋪8個96孔板,置入5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。鋪板后24 h取出一塊板,吸出原培養(yǎng)液后加入含F(xiàn)BS及雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)液100μL及濃度為5 mg/m L的MTT溶液20μL。繼續(xù)培養(yǎng)4 h,隨后終止培養(yǎng),吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液,每孔加入150μL DMSO,振蕩10min,在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值,波長492,記錄結(jié)果。每24 h重復上述步驟1次,直至第8天。以時間為橫坐標,吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線。實驗重復3次。

1.2.4 Matrigel Transwell小室細胞侵襲實驗 將Matrigel 40μL均勻鋪在Transwell小室內(nèi),靜置30min。取對數(shù)生長期的A549-CD137L(+),A549-CD137L(-),A549-control細胞各2×105個,加入150μL無血清含雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)液中,置入Transwell小室內(nèi)。Transwell小室置于24孔板內(nèi),板內(nèi)加入600μL含15%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液,并置于37℃恒溫孵育箱培養(yǎng)。48 h后擦除小室內(nèi)部Matrigel膠及膠上未遷出細胞,PBS液洗3min×3次,4%多聚甲醛固定0.5 h,常規(guī)HE染色。隨機選取4個高倍視野(200×)計數(shù)細胞。實驗重復3次。

1.2.5 IL-6、IL-8水平檢測:將 A549-CD137L(+),A549-CD137L(-),A549-control3組細胞,在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d,收集細胞培養(yǎng)的上清液,固定到硝酸纖維素膜中;具體步驟按照ELISA酶聯(lián)吸附檢測試劑盒說明書操作檢測IL-6、IL-8的水平。

1.3 統(tǒng)計學方法 采SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析,正態(tài)計量資料采用“±s”表示,組間比較采用t檢驗,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Western blot檢測細胞CD137L白表達 Western blot結(jié)果顯示:與A549細胞中CD137L蛋白表達量相比,A549-TC-1(+)細胞CD137L蛋白表達明顯增多,A549-TC-1(-)細胞明顯減少,A549-control無明顯變化差別(見圖1)。表明3種載體構建成功,能用于下游實驗。

圖1 4組細胞CD137L蛋白表達比較1.A549-CD137L(+);2.A549-CD137L(-);3.A549;4.A549-control#P＜0.05,與3(A549組)比較Fig.1 CD137L-protein expression in four groups1.A549-CD137L(+);2.A549-CD137L(-);3.A549;4.A549-control#P＜0.05,compared with A549 group

2.2 CD137L對肺癌A549細胞增殖的影響 MTT結(jié)果顯示:A549-CD137L(+)細胞增殖最快,A549-CD137L(-)最慢;3組細胞數(shù)在第三天差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),第4天出現(xiàn)明顯統(tǒng)計學差異(P＜0.01)。表明 CD137L基因的表達對肺癌A549細胞的增殖能力有正調(diào)節(jié)效應(見圖2)。

圖2 3組細胞增殖能力比較#P＜0.05,##P＜0.01,與A549-control組比較Fig.2 Comparison of cell proliferation in three A549 cells#P＜0.05,##P＜0.01,compared with A549-control group

2.3 CD137L對肺癌A549細胞侵襲能力的影響 利用Transwell小室模擬血管基底膜的人工基底膜Matrigel膠,通過計數(shù)穿過Matrigel膠及Transwell小室膜的A549細胞數(shù)量來檢測腫瘤細胞的體外侵襲能力。結(jié)果顯示:與A549-control相比,A549-CD137L(+)細胞穿膜數(shù)量明顯增加,而A549-CD137L(-)細胞穿膜數(shù)量明顯降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。提示CD137L對肺癌A549細胞的侵襲能力有正調(diào)節(jié)作用(見圖3)。

圖3 3組細胞侵襲能力比較#P＜0.05,與A549-control組比較Fig.3 Comparison ofmigration ability in three groups#P＜0.05,compared with A549-control group

2.4 CD137L對A549細胞IL-6、IL-8水平的影響 ELISA實驗結(jié)果表明:與A549-control組細胞中細胞因子IL-6、IL-8的分泌水平相比,A549-CD137L(+)細胞中的IL-6、IL-8分泌量明顯升高,A549-CD137L(-)細胞中IL-6、IL-8分泌量明顯降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。表明CD137L的高表達可以促進細胞因子IL-6、IL-8的分泌量(見表1)。

3 討論

惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移與很多因素有關,包括腫瘤在原發(fā)部位的生長,腫瘤離開原發(fā)灶進入脈管系統(tǒng),腫瘤到達遠隔臟器并繼續(xù)生長。其中腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲是其生物學行為的關鍵步驟。肺癌的局部增殖不僅表現(xiàn)為原發(fā)腫瘤的體積增大,更是原發(fā)腫瘤浸潤脈管系統(tǒng)發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要生物學因素,而轉(zhuǎn)移是導致肺癌病人死亡的主要原因,也是肺癌治療的難點［8-9］。因此,打破腫瘤患者的免疫耐受,激活體內(nèi)的免疫功能是當前肺癌免疫治療的主要方向。CD137L作用于CD137后可以通過TRAF2、TRAF1和MAPK等途徑傳遞細胞內(nèi)信號,調(diào)節(jié)細胞因子的釋放,影響生物學行為［10］。已經(jīng)證實CD137L在實體瘤上有表達,主要在NSCLC細胞膜和細胞質(zhì),以及部分細胞核內(nèi)表達,然而在非轉(zhuǎn)換的細胞中無表達,推測腫瘤細胞表達CD137L可能誘導保護性抗腫瘤免疫的產(chǎn)生［11］。研究發(fā)現(xiàn)CD137 L在人NSCLC的表達與患者年齡、性別和病理類型等無明顯的相關性,但與患者病理分期以及預后有一定的聯(lián)系;且CD137L陽性表達的患者生存期較CD137L陰性表達的患者延長,說明高表達CD137L能延長患者的生存時間,為NSCLC免疫治療提供依據(jù)［5］。研究證實CD137L在多種腫瘤細胞株及腫瘤組織上可組成性表達,CD137和CD137L的相互作用可以促進細胞株的增殖、延長其生存、并降低抗腫瘤藥物的效應［12］。另外,CD137L通過與表達在T細胞表面的CD137交聯(lián)可以促進T細胞的活化、增殖,增加細胞因子的分泌及活化誘導的細胞凋亡(AICD)的抑制,同時也介導反向共刺激信號,因此T細胞與巨噬細胞通過CD137/CD137L雙向作用而相互活化,介導雙向信號傳導,促進免疫反應,可以運用于人類的腫瘤免疫治療［13-14］。

IL-6是一種多功能蛋白,主要為單核-巨噬細胞和活化的T細胞。它不僅作用于多種免疫活性細胞,造血細胞,參與機體的炎癥反應,還可以作為自分泌生長因子發(fā)揮雙向性調(diào)節(jié)作用,調(diào)節(jié)機體對腫瘤細胞的免疫反應,從而加強或抑制腫瘤的生長。IL-8是趨化因子超家族中的一員,具有激活和趨化嗜中性粒細胞,參與機體炎癥反應。同時也是腫瘤血管的形成因子,促進腫瘤新生血管形成,并可誘導腫瘤細胞的移動,刺激某些腫瘤細胞的生長并使細胞表達黏附分子等,在腫瘤的生長轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。

本文通過體外建立穩(wěn)定過表達和低表達CD137L的肺癌A549細胞系,用單一因素影響肺癌細胞,研究CD137L基因?qū)Ψ伟┘毎飳W能力的影響。實驗結(jié)果顯示:CD137L對于肺癌細胞的增殖、侵襲能力具有正性調(diào)節(jié)功能,具體表現(xiàn)為CD137L表達增高的A549細胞其增殖、遷移及侵襲能力增強,而CD137L表達降低的A549細胞其增殖、遷移及侵襲能力減弱。說明CD137L基因的表達增高能夠促進細胞增殖、遷移,并對肺癌A549細胞侵襲能力有正調(diào)節(jié)效力。各組細胞中IL-6、IL-8的水平結(jié)果顯示:CD137L高表達的細胞中IL-6、IL-8分泌量明顯高于CD137L低表達和正常組,說明CD137L能通過增加細胞因子IL-6的分泌,作用于腫瘤細胞,促進腫瘤的生長;增加自分泌因子IL-8的水平,促進腫瘤血管形成,從而誘導腫瘤細胞增殖,影響腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

CD137L分子被認為是T細胞的共刺激分子,CD137/CD137L信號引起的生物學效應十分復雜,這種復雜的生物學效應得到初步研究。CD137配體受體之間的雙向信號使許多免疫細胞與免疫細胞、免疫細胞和非免疫細胞之間產(chǎn)生交聯(lián),并將這種細胞之間產(chǎn)生的交聯(lián)作用及時反饋,使調(diào)節(jié)機體作用更加精確［15］。CD137L作為共刺激分子,因其逆向信號的存在,使CD137L的作用不單是提供第二信號引起T細胞活化的功能。表明CD137L參與腫瘤的發(fā)展,通過與 CD137交聯(lián)向表達CD137L的腫瘤細胞傳遞逆向信號,產(chǎn)生的效應可以是增強免疫,也可以使機體腫瘤細胞逃避免疫監(jiān)視,影響機體免疫功能。CD137L對于腫瘤細胞的增殖、侵襲具體的作用機制以及相關的信號通路都還有待進一步研究,以期為腫瘤免疫治療提供新的思路。

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(編校:吳茜)

The role and mechanism of CD137L in non-small cell lung cancer proliferation,m igration and invasion

ZHENG Fang-xia1,LIXue-zhang2,ZHENGWei-xia2,CHENG Yu-feng1Δ,SHENG Yan-xing2,GAOWen3

(1.Department of Radiation Oncology,Qilu Hospital of Shandong University,Jinan 250012,China;2.Department of Radiation Oncology,Liaocheng People's Hospital,Liaocheng 252000,China;3.Department of Clinical Medicine,Nanjing Medical University,Nanjing 210029,China)

Objective To study CD137L expression in non-small cell lung cancer,its effect on cell proliferation,migration and invasion and explore the molecular mechanisms of non-small cell lung cancer invasion and metastasis.Methods Lentiviral vectors of CD137L overexpression,CD137L-RNA interference and A549 controlwere constructed and transfected into A549 cell.CD137L protein expression in three groupswere detected by Western blot;cell proliferation assay were conducted by MTT;cancer cells proliferation,invasiveness were measured by Matrigel transwell chamber invasion assay;IL-6 and IL-8 levels in cell supernatants were detected by ELISA method.Results Western blot results showed that:compared with A549 cell,CD137L protein expression in A549-TC-1(+)cell increased significantly,A549-TC-1(-)cell decreased significantly,the differences were all statistically significant(P＜0.05),and therewas little change in transfected A549-control cell,which indicating that three kinds of viral vectors can be used for subsequent experiments..MTT and matrigel transwell chamber invasion assay results showed that:compared with A549-control cell,A549-TC-1(+)cell proliferation migration and invasion capacitywere enhanced,and A549-TC-1(+)cellwereweakened,the differenceswere all statistically significant(P＜0.05).ELISA results showed that cell serum IL-6,IL-8 levels in A549-TC-1(+)cell were all significantly higher than A549-TC-1(-)cell and normal A549 cell a groups.Conclusion CD137L can regulate non-small cancer cell proliferation and invasion positivily,the mechanism may related to increasing IL-6,IL-8 secretion and thereby enhancing tumor growth,proliferation and invasion.

CD137L;non-small cell lung cancer;proliferation;migration;invasion

R734

A

1005-1678（2014)06-0014-04

國家自然科學基金(81101759)

鄭芳霞，女，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：腫瘤放療、化療及基礎研究，E-mail：15006396314@163.com；程立峰，通信作者，男，主任醫(yī)師，博士生導師，研究方向：腫瘤的放療、化療，E-mail：qlcyf@126.com。