王穎,郭人花

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科,河南 新鄉(xiāng) 453100;2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科,江蘇 南京 210029)

miR-181a-5p在非小細胞肺癌中抗癌機制的研究

王穎1,郭人花2

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科,河南 新鄉(xiāng) 453100;2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科,江蘇 南京 210029)

目的 探索miR-181a-5p的抑癌機制，探討其是否可作為臨床檢測肺癌的標志物。方法 采用CCK8法檢測非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC)細胞株A549細胞增殖情況；流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡；細胞劃痕和Transwell實驗檢測miR-181a-5p對A549細胞運動的影響；利用雙熒光報告基因?qū)嶒灪蚏T-PCR實驗探討miR-181a-5p與靶基因的相互作用。結(jié)果 在非小細胞肺癌細胞株A549中過表達miR-181a-5p能明顯抑制A549細胞株的增殖，促進細胞的早期凋亡（P＜0.05)。細胞劃痕和Transwell實驗結(jié)果表明miR-181a-5p能明顯抑制細胞的運動（P＜0.05)；miR-181a-5p可通過3'UTR靶向下調(diào)Kras基因的表達，且在NSCLC中Kras表達與miR-181a-5p表達有一定關(guān)系。結(jié)論 miR-181a-5p可顯著抑制NSCLC A549細胞的生物進程，是潛在的治療NSCLC的靶標。

miR-181a-5p；增殖；遷移；凋亡；非小細胞肺癌

在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中,miRNA通過調(diào)控基因表達影響細胞功能,起抑癌或促癌作用［1-2］。起抑癌作用的miRNA主要通過調(diào)控功基因來抑制細胞的增殖、遷移或促進細胞的凋亡來抑制腫瘤的發(fā)生［3-8］。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 非小細胞肺癌細胞株A549購自中科院生化細胞所細胞庫。

1.2 實驗儀器 FLx8酶標儀(BIO-RAD),C1000TMThermal Cycler PCR儀(BIO-RAD),TGL-18000-CR高速臺式離心機(上海安亭科學(xué)儀器制造有限公司),SW-CJ-2F超凈工作臺(蘇靜安泰有限公司),SW-CJ-2F多功能脫色搖床(上海智成分析儀器制造有限公司),XW-80A漩渦混合儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司),JY92-11超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技有限公司),PK-SZZ電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設(shè)備有限公司),PL203電子分析天平(METTLER TOLEDO上海有限公司),CFX96qRT-PCR儀(BIO-RAD),LRH-250F CO2恒溫培養(yǎng)箱(SHELLAB),MLS-3708高壓滅菌鍋(SANYO)。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng):非小細胞肺癌細胞株A549培養(yǎng)在含有10%胎牛血清、青霉素105IU/L、鏈霉素100 mg/L的1640和DMEM培養(yǎng)基中,培養(yǎng)基于37℃,5%CO2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細胞融合到85%左右時,用0.25%胰酶消化,傳代［9］。

1.3.2 細胞增殖實驗:取對數(shù)生長期的細胞,以1×104個/mL的密度接種于96孔培養(yǎng)板中,每孔接種100μL,培養(yǎng)待細胞貼壁后,再分別加入miR-181a-5p、anti-miR-181a-5p,每組設(shè)置6個復(fù)孔,同時設(shè)置不受處理因素的對照組(NC),也設(shè)置6個復(fù)孔。分別培養(yǎng)24、48 h后,每孔加入25μL的MTT噻唑藍,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后小心棄去培養(yǎng)液,再每孔加入150μL的DMSO,于搖床上振搖10min,充分溶解生成的結(jié)晶,然后于490 nm波長處測定各組的光吸收值(OD值),重復(fù)3次,取均值。用下面的公式計算各組藥物的細胞的抑制率［10-11］:抑制率=(1-藥物組OD值/對照組OD值)×100%。

1.3.3 流式細胞儀檢測:按照流式細胞儀檢測細胞凋亡試劑盒操作,以適量的胰酶消化、收集轉(zhuǎn)染后的A549細胞,磷酸鹽緩沖液洗滌、重懸細胞,2 000 r/min,5min收集(1×105)～(5×105)個細胞,離心沉淀,加入500 uL Binding Buffer重懸細胞,向重懸液中加入5 uL Annexin V-FITC染色,隨后加入5 uL PI染色,室溫下避光孵育15m in,流式細胞儀檢測凋亡率,實驗重復(fù)3次。

1.3.4 miR-181a-5p靶基因的鑒定:從A549細胞中提取總RNA,并反轉(zhuǎn)成cDNA后用來作為PCR的模板,成功的得到了5種靶基因的目的片段。經(jīng)割膠回收后,在37℃用相適應(yīng)的限制性內(nèi)切酶酶切2 h后,用T4 DNA連接酶16℃連接過夜后,轉(zhuǎn)化TOP10大腸桿菌感受態(tài)細胞。挑取單克隆經(jīng)擴大培養(yǎng)后,提取質(zhì)粒,送至上海英俊生物公司測序。經(jīng)序列比對無誤后,用無內(nèi)毒素質(zhì)粒大抽試劑盒提取重組質(zhì)粒。抽得重組質(zhì)粒,用限制性內(nèi)切酶酶切驗證。

1.3.5 細胞運動實驗:在顯微鏡載物臺上靜置細胞2.5 h,通過攝像頭、監(jiān)控儀、錄像機等設(shè)備記錄整個過程,然后通過圖像轉(zhuǎn)化和采集系統(tǒng)保存實驗照片。用Imagine Tool和Image-Pro Plus 6.0測量每個時間點內(nèi)的幾何中心二維坐標,用Microsoft Excel2013XY散點圖繪制細胞遷移軌跡,時間間隔為5min,每張圖取5個細胞求平均數(shù)。

1.3.6 qRT-PCR分析基因表達:A549細胞,對照組轉(zhuǎn)染NC,實驗組轉(zhuǎn)染miR-181a-5p,在mRNA水平檢測miR-181a-5p對靶基因的下調(diào)情況,靶基因里除了預(yù)測的基因,還包括文獻中已經(jīng)報道m(xù)iR-181a-5p明確的靶基因,如 BCL2L11［12-13］,但這些基因在非小細胞肺癌中并未驗證,而是在其它癌癥中做過相關(guān)研究,引物來源于哈弗醫(yī)學(xué)院的引物庫 (http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/)。

2 結(jié)果

2.1 miR-181a-5p抑制細胞增殖和克隆形成 細胞克隆實驗結(jié)果顯示:上調(diào)miR-181a-5p會顯著抑制細胞株A549的增殖(圖1A),細胞用結(jié)晶紫染料染色。通過qRT-PCR檢測細胞轉(zhuǎn)染效率,發(fā)現(xiàn)miR-181a-5p將近上調(diào)了40倍(圖1B)。細胞轉(zhuǎn)染miR-181a-5p后增殖能力低于轉(zhuǎn)染NC的對照組,而轉(zhuǎn)染antimiR-181a-5p的實驗組對比NC增殖能力有所提升(圖1C、D)。軟瓊脂實驗中,對比NC,過表達miR-181a-5p抑制了細胞克隆的形成,細胞克隆的數(shù)量和大小均有顯著的差異(P＜0.05,圖1E,F),這幾個實驗證明了過表達miR-181a-5p對A549細胞增殖具有抑制作用。

圖1 miR-181a-5p對A549細胞增殖的影響Fig.1 Effect ofmiR-181-a-5p on A549 cell proliferation

2.2 miR-181a-5p對細胞凋亡的影響 流式結(jié)果表明:實驗組在轉(zhuǎn)染miR-181a-5p 48h后早期凋亡提高了6.37%(見圖2)。說明miR-181a-5p表達上調(diào)促進了細胞的早期凋亡。

圖2 miR-181a-5p對A549細胞凋亡的影響Fig.2 Effect ofmiR-181-a-5p on A549 cell apoptosis

2.3 過表達miR-181a-5p對A549細胞的運動和遷移的影響 細胞劃痕法結(jié)果表明細胞轉(zhuǎn)染miR-181a-5p后細胞遷移率顯著降低,只有大約18%,而細胞轉(zhuǎn)染anti-miR-181a-5p后具有較高的運動水平,細胞遷移率接近45%(圖3A、3C)。Transwell實驗結(jié)果顯示與對照組NC相對比,實驗組穿過Transwell小皿的細胞數(shù)量在轉(zhuǎn)染miR-181a-5p后顯著減少,約為75個細胞(圖3B、3D)。表明轉(zhuǎn)染miR-181a-5p的A549細胞的遷移受到了顯著的抑制(P＜0.05)。

圖3 miR-181a-5p對A549細胞運動的影響Fig.3 Effect ofmiR-181-a-5p on themovement of A549 cell

2.4 miR-181a-5p靶基因的鑒定

2.4.1 PCR產(chǎn)物連接載體:載體酶切位點信息(見圖4),酶切后對比片段大小。

圖4 PGL3載體上酶切位點及相關(guān)信息Fig.4 PGL3 vector restriction sites and related information

2.4.2 雙熒光報告基因分析:重組載體與miR-181a-5p的mimics共轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞48 h后,分別檢測各組海腎熒光素酶和螢火蟲熒光素酶的活性,以轉(zhuǎn)入NC和重組質(zhì)粒的作為對照組。結(jié)果表明5種靶基因的3'-UTR均受到了miR-181a-5p的調(diào)控,其中以Kras和PLAG1受到的調(diào)控最為明顯,相比轉(zhuǎn)入NC的對照組顯著下降了50%左右,其中的Kras因為在3'-UTR發(fā)現(xiàn)2個結(jié)合位點,因此在克隆Kras時共克隆了3個載體,第一個載體含有miR-181a-5p的第一個結(jié)合位點,第二個載體上的片段含miR-181a-5p的另一個結(jié)合位點,第三個載體連上的片段包含有miR-181a-5p結(jié)合的2個位點(見圖5)。從結(jié)果可以看出這些基因的3'-UTR受到miR-181a-5p的調(diào)控,而Kras基因的2個位點都有不同程度的下調(diào),同時包含有2個結(jié)合位點的載體比其中任何一個都較為明顯,推測這2個結(jié)合位點都是有效的。

圖5 miR-181a-5p與其可能的靶基因的熒光實驗結(jié)果

圖6 miR-181a-5p過表達對靶基因mRNA水平的影響

2.4.3 qRT-PCR分析轉(zhuǎn)染miR-181a-5p后基因下調(diào)情況:本實驗結(jié)果顯示在這些靶基因中Kras的mRNA下調(diào)情況最為顯著(圖6A),而原先在乳腺癌中報道的BCL2L11為miR-181a-5p的靶基因,在非小細胞肺癌中得到相反的結(jié)果,靶基因在mRNA水平反而上調(diào)了。因此,推測miR-181a-5p或BCL2L11所扮演的角色具有組織或者細胞特異性。即不同的基因在不同的組織或細胞中調(diào)控的通路或者網(wǎng)絡(luò)存在差異性。

對照組轉(zhuǎn)染NC,結(jié)果顯示:和對照組相比,實驗組的許多抑癌基因表達量有所上調(diào),一些促進凋亡的基因表達量相對升高如(圖6B);miR-379,miR-30a,miR-126-3p,有顯著的下調(diào),而在其它癌癥中比較明確發(fā)揮抑癌功能的miR-34a的表達量顯著上調(diào),這進一步證明了miR-181a-5p調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性,以及在非小細胞肺癌中發(fā)揮抑癌基因的功能。

圖7 miR-181a-5p通過靶向結(jié)合3'-UTR下調(diào)Kras的表達Fig.7 Expression ofmiR-181a-5p in Kras to combine 3'-UTR through the target

2.4.4 miR-181a-5p靶基因的驗證:為了驗證miR-181a-5p可以直接作用于Kras的3′-UTR,調(diào)控其在mRNA和蛋白水平的表達,并明確結(jié)合位點,實驗已構(gòu)建好的PGL3載體為模版,做載體突變實驗,將載體上的miR-181a-5p的結(jié)合位點TGAATGT突變成CGGACGC如(圖7A)所示,突變后的位點經(jīng)轉(zhuǎn)錄后將不能和miR-181a-5p結(jié)合。突變采用傳統(tǒng)的引物隔花突變,隔一個堿基做一個突變,突變采用高保真酶進行,PCR后的產(chǎn)物因為有原來大抽的載體,即實驗中作為模版的載體和PCR的突變產(chǎn)物載體,因此需要去除原來未突變的載體。大抽的載體因為在菌體里有經(jīng)過甲基化,而PCR的突變載體沒有甲基化,所以我們可以在整個產(chǎn)物中加入甲基化酶來破壞原有的模版載體,再進行轉(zhuǎn)化和測序,并進行熒光實驗驗證,結(jié)果如圖7B所示。然而,內(nèi)源的Kras在蛋白水平是否受到miR-181a-5p的調(diào)控?如圖7C所示,轉(zhuǎn)染miR-181a-5p的實驗組 Kras的蛋白水平下調(diào)了將近75%,而轉(zhuǎn)染anti-miR-181a-5p的實驗組和NC相比也有顯著的區(qū)別。因此,本實驗證明了miR-181a-5p可以在mRNA和蛋白水平對靶基因Kras進行調(diào)控。

2.4.5 DNA甲基化對miR-181a-5p表達的影響:采用甲基化酶抑制劑處理A549細胞,發(fā)現(xiàn)miR-181a-5p的轉(zhuǎn)錄水平顯著提升(見圖8),推測未加甲基化酶抑制劑的對照組受到甲基化酶的調(diào)控,影響miR-181a-5p的表達,而Kras作為 miR-181a-5p靶向調(diào)控的基因,在miR-181a-5p表達水平上升時發(fā)生下調(diào)也是合理的。

圖8 加入甲基化酶抑制劑后miR-181a-5p和Kras的表達Fig.8 Expression ofmiR-181a-5p and Kras after added methylation enzyme inhibitor

3 討論

本研究證明了miR-181a-5p和Kras存在負相關(guān)的關(guān)系,miR-181a-5p在A549細胞株中發(fā)揮抑癌基因的功能,在病例樣本中,病人的年齡以及癌癥的惡性程度越高,相應(yīng)的miR-181a-5p表達量比較低。而Kras則隨年齡和惡性程度的升高而表達量上升。細胞株中miR-181a-5p的表達量普遍顯著下調(diào)。之前報道［14-15］的乳腺癌中miR-181a可以下調(diào)BCL2L11并發(fā)揮抑癌基因的功能,但在A549中過表達miR-181a-5p后BCL2L11卻出現(xiàn)上升的情況,因此推測基因具有組織或細胞特異性。細胞癌化到一定階段往往具有遷移性,從而導(dǎo)致腫瘤的擴散。起抑癌作用的miRNA可能通過調(diào)控一些基因,影響細胞的遷移,細胞遷移也是癌癥進程的一項重要指標。本實驗運用兩種相類似的方法共同驗證miR-181a-5p對細胞遷移的影響。此外,miR-181a-5p對其它miRNA也有調(diào)控作用,miR-34a在轉(zhuǎn)染miR-181a-5p后有顯著的上調(diào)。通過這些實驗暗示了miR-181a-5p在非小細胞肺癌中能影響多樣的細胞進程,通過靶向基因調(diào)控發(fā)揮作用。

DNA甲基化是一種表觀遺傳修飾,在甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下,S-腺苷甲硫氨酸提供甲基,選擇性地添加甲基到DNA的CG兩個核苷酸,形成5-甲基胞嘧啶?；虻膯幼訁^(qū)CpG島在正常情況下一般是非甲基化的,當發(fā)生甲基化時,時常發(fā)生基因的轉(zhuǎn)錄沉寂,使一些抑癌基因喪失功能,從而導(dǎo)致正常的細胞調(diào)控失常,與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示miR-181a-5受到甲基化調(diào)控。

腫瘤的治療還需要解決一些技術(shù)問題,需要選擇合適的給藥載體和給藥方式使藥物可以準確地送達病灶。除了技術(shù)問題我們還應(yīng)順著調(diào)控網(wǎng)絡(luò)追溯到源頭,鑒定miRNA的啟動子及轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,相信隨著新技術(shù)的不斷發(fā)展,這些機制將會向我們揭開神秘面紗,使miRNA應(yīng)用到各類疾病的應(yīng)用和治療中。

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(編校:吳茜)

Analysis ofm iR-181a-5p function in non-small cell lung cancer

WANG Ying1,GUO Ren-hua2

(1.Department of Internal Medicine-Oncology,The First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University,Henan 453100,China;2.Department of Internal Medicine-Oncology,The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing 210029,China)

Objective The aims of this study were to explore the biologic functions ofmiR-181a-5p in NSCLC and investigate whether it can be a marker for detecting NSCLC.Methods A549 cell growth and apoptosis after transfected miR-181a-5p were examined by CCK8 and flow cytometry,respectively,themovement of A549 cell were detected by Transwell assay and wound healing assay.Interaction ofmiR-181a-5p and its possible target genes were detected by dual luciferase reporter assay.Results MiR-181a-5p inhibited A549 cell proliferation,promoted cell apoptosis in vitro.Transwell assay and wound healing assay showed thatmiR-181-5p negatively regulated cellmigration in vitro.MiR-181a-5p down-regulated Kras expression by directly targeting its 3′-UTR.Kraswas inversely correlated withmiR-181a-5p expression in NSCLC.Conclusion MiR-181a-5p might provide a potential treatment approach for NSCLC patients.

miR-181a-5p;proliferation;migration;apoptosis;non small cell lung cancer

R655

A

1005-1678（2014)06-0006-05

2011年國家自然科學(xué)基金(81172217)

王穎，女，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：惡性腫瘤的綜合治療，E-mail：qch1821460017@163.com。