王偉+朱佩燕

摘 要：以擬南芥的根和葉片為材料，對利用Spurr樹脂低粘度包埋劑進行植物樣品包埋技術進行了討論和改進。

關鍵詞：半薄切片；Spurr樹脂；技術

中圖分類號 Q81 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2014）16-16-02

半薄切片技術是將以樹脂作為包埋劑，用超薄切片機或石蠟切片機進行切片的技術。通過該技術所得到的切片厚度一般為0.5～3μm，介于超薄切片和石蠟切片之間，因而被稱為半薄切片，通常用于光學顯微鏡進行較細微組織的觀察，或用于電子顯微鏡的初步組織定位[1-2]。半薄切片的制備與電鏡超薄切片的步驟較為類似，也需要經(jīng)過固定、脫水、包埋、切片和染色等步驟，但由于其組織結(jié)構(gòu)保存較好，而且切片較薄，因此在光鏡下對于較細微組織結(jié)構(gòu)的觀察效果要比常規(guī)石蠟切片好，目前已被廣泛應用于植物各個組織的顯微結(jié)構(gòu)的觀察。

傳統(tǒng)上常采用Epon 812作為包埋劑來制備半薄切片，但由于植物細胞具有細胞壁，尤其對于根尖及種子等材料，其具有致密的細胞結(jié)構(gòu)，而Epon 812樹脂的粘度較高，因而在使用Epon 812樹脂作為包埋劑時，有時會出現(xiàn)滲透不好的問題，切片過程中出現(xiàn)空洞或破碎等現(xiàn)象；且由于Epon 812樹脂易吸潮，在濕度大的時候容易發(fā)軟，使得難以切出較好的樣品[3]。而低黏度包埋劑Spurr樹脂相對于Epon 812樹脂，具有黏度低、滲透效果好、所需聚合時間短等優(yōu)點，更適用于植物材料的包埋處理。本文利用Spurr樹脂作為包埋劑制備了擬南芥的葉及根的半薄切片，并對利用Spurr樹脂包埋制備植物半薄切片的方法及可能遇到的一些問題進行了探討。

1 材料與方法

1.1 供試材料 擬南芥成熟葉片及根。Spurr樹脂包埋試劑盒購自美國polyscience公司，由ERL4221樹脂、D.E.R736增塑劑、NSA硬化劑和DMAE催化劑4種成分組成。

1.2 實驗方法 取新鮮葉片或根用雙面刀片切成3～5mm厚的薄片或小段，放入含有4%（w/v）多聚甲醛、2%（w/v）戊二醛的50mM的二甲基砷酸鈉緩沖液（pH7.2）中，抽氣后置于4℃固定24h以上。然后用50mM的二甲基砷酸鈉緩沖液分4次，每次浸泡15min進行清洗，然后將樣品轉(zhuǎn)移至含有2%鋨酸的二甲基砷酸鈉緩沖液中放置2h進行前染色，再次用50mM的二甲基砷酸鈉緩沖液分4次，每次浸泡15min進行清洗，經(jīng)25%，50%，75%，95%和100%乙醇逐級脫水，每級不少于30min。無水乙醇脫水2h以上，并經(jīng)環(huán)氧丙烷進一步置換脫水2次，每次10～20min，將預先混合配制好的Spurr樹脂和環(huán)氧丙烷按1∶1滲透1h以上，再次用Spurr樹脂滲透樣品2h。利用小的PCR管或EP管為模具，將樣品置于樹脂中進行包埋，70℃聚合24h以上，冷卻后即可進行半薄切片。切片厚度通常為1～2μm，用睫毛筆撈片至載玻片上，加水放展片臺上60℃進行展片，并滴加0.5%結(jié)晶紫溶液進行染色。

2 結(jié)果與分析

3 討論

（1）Spurr樹脂生產(chǎn)商廠家給出的標準配方。但由于Spurr樹脂受溫度和濕度影響較大，因此，在實際應用時，應當根據(jù)氣候和工作條件的不同來調(diào)整配方。一般在北方的冬季需適當增加增塑劑的含量，而在夏季和南方等雨水較多地區(qū)則應適當增加硬化劑的含量。由于包埋試劑盒中的硬化劑NSA對水分敏感，因此混合好的樹脂應存放于密閉的干燥器中，盡量減少暴露于空氣中的時間，并盡快與材料共同轉(zhuǎn)入PCR或EP管中蓋緊蓋子進行聚合。由于Spurr樹脂中的成分可與硅膠反應，應盡量避免使用硅膠模具，防止兩者之間粘連導致包埋塊難以取出或變脆。

（2）在包埋樣品時，應根據(jù)所需進行切片的方向?qū)Σ牧衔恢眠M行調(diào)整。對于擬南芥根或葉片較為細薄的樣品，可在樣品下沿與樣品軸向垂直方向放置一根或若干根干凈的頭發(fā)絲，避免樣品過于接近包埋塊的邊緣，從而有利于修塊并防止由于過于接近包埋塊邊緣而在切片時出現(xiàn)碎裂現(xiàn)象。

（3）在進行染色的過程中，則需要保持在60℃加熱條件下滴加結(jié)晶紫溶液進行染色，染色液配置后需過濾去除雜質(zhì)后才可使用，染色2～3min后用水蒸餾水洗去多余染液，濾紙吸干，于60℃繼續(xù)展片干燥后即可觀察或中性樹膠封片。

參考文獻

[1]李和平.植物顯微技術[M].北京：科學出版社，2009：67-78.

[2]于紅麗，張大紅，徐夏紅，等.電鏡半薄切片制備方法的改進[J].徐州醫(yī)學院學報，2004，24（2）：129-130.

[3]楊瑞，范敬偉，劉文可，等.植物透射電鏡樣品制備技術的改進及不同樹脂選擇比較[J].北京農(nóng)學院學報，2013，28（4）：5-7.

（責編：張宏民）endprint

摘 要：以擬南芥的根和葉片為材料，對利用Spurr樹脂低粘度包埋劑進行植物樣品包埋技術進行了討論和改進。

關鍵詞：半薄切片；Spurr樹脂；技術

中圖分類號 Q81 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2014）16-16-02

半薄切片技術是將以樹脂作為包埋劑，用超薄切片機或石蠟切片機進行切片的技術。通過該技術所得到的切片厚度一般為0.5～3μm，介于超薄切片和石蠟切片之間，因而被稱為半薄切片，通常用于光學顯微鏡進行較細微組織的觀察，或用于電子顯微鏡的初步組織定位[1-2]。半薄切片的制備與電鏡超薄切片的步驟較為類似，也需要經(jīng)過固定、脫水、包埋、切片和染色等步驟，但由于其組織結(jié)構(gòu)保存較好，而且切片較薄，因此在光鏡下對于較細微組織結(jié)構(gòu)的觀察效果要比常規(guī)石蠟切片好，目前已被廣泛應用于植物各個組織的顯微結(jié)構(gòu)的觀察。

傳統(tǒng)上常采用Epon 812作為包埋劑來制備半薄切片，但由于植物細胞具有細胞壁，尤其對于根尖及種子等材料，其具有致密的細胞結(jié)構(gòu)，而Epon 812樹脂的粘度較高，因而在使用Epon 812樹脂作為包埋劑時，有時會出現(xiàn)滲透不好的問題，切片過程中出現(xiàn)空洞或破碎等現(xiàn)象；且由于Epon 812樹脂易吸潮，在濕度大的時候容易發(fā)軟，使得難以切出較好的樣品[3]。而低黏度包埋劑Spurr樹脂相對于Epon 812樹脂，具有黏度低、滲透效果好、所需聚合時間短等優(yōu)點，更適用于植物材料的包埋處理。本文利用Spurr樹脂作為包埋劑制備了擬南芥的葉及根的半薄切片，并對利用Spurr樹脂包埋制備植物半薄切片的方法及可能遇到的一些問題進行了探討。

1 材料與方法

1.1 供試材料 擬南芥成熟葉片及根。Spurr樹脂包埋試劑盒購自美國polyscience公司，由ERL4221樹脂、D.E.R736增塑劑、NSA硬化劑和DMAE催化劑4種成分組成。

1.2 實驗方法 取新鮮葉片或根用雙面刀片切成3～5mm厚的薄片或小段，放入含有4%（w/v）多聚甲醛、2%（w/v）戊二醛的50mM的二甲基砷酸鈉緩沖液（pH7.2）中，抽氣后置于4℃固定24h以上。然后用50mM的二甲基砷酸鈉緩沖液分4次，每次浸泡15min進行清洗，然后將樣品轉(zhuǎn)移至含有2%鋨酸的二甲基砷酸鈉緩沖液中放置2h進行前染色，再次用50mM的二甲基砷酸鈉緩沖液分4次，每次浸泡15min進行清洗，經(jīng)25%，50%，75%，95%和100%乙醇逐級脫水，每級不少于30min。無水乙醇脫水2h以上，并經(jīng)環(huán)氧丙烷進一步置換脫水2次，每次10～20min，將預先混合配制好的Spurr樹脂和環(huán)氧丙烷按1∶1滲透1h以上，再次用Spurr樹脂滲透樣品2h。利用小的PCR管或EP管為模具，將樣品置于樹脂中進行包埋，70℃聚合24h以上，冷卻后即可進行半薄切片。切片厚度通常為1～2μm，用睫毛筆撈片至載玻片上，加水放展片臺上60℃進行展片，并滴加0.5%結(jié)晶紫溶液進行染色。

2 結(jié)果與分析

3 討論

（1）Spurr樹脂生產(chǎn)商廠家給出的標準配方。但由于Spurr樹脂受溫度和濕度影響較大，因此，在實際應用時，應當根據(jù)氣候和工作條件的不同來調(diào)整配方。一般在北方的冬季需適當增加增塑劑的含量，而在夏季和南方等雨水較多地區(qū)則應適當增加硬化劑的含量。由于包埋試劑盒中的硬化劑NSA對水分敏感，因此混合好的樹脂應存放于密閉的干燥器中，盡量減少暴露于空氣中的時間，并盡快與材料共同轉(zhuǎn)入PCR或EP管中蓋緊蓋子進行聚合。由于Spurr樹脂中的成分可與硅膠反應，應盡量避免使用硅膠模具，防止兩者之間粘連導致包埋塊難以取出或變脆。

（2）在包埋樣品時，應根據(jù)所需進行切片的方向?qū)Σ牧衔恢眠M行調(diào)整。對于擬南芥根或葉片較為細薄的樣品，可在樣品下沿與樣品軸向垂直方向放置一根或若干根干凈的頭發(fā)絲，避免樣品過于接近包埋塊的邊緣，從而有利于修塊并防止由于過于接近包埋塊邊緣而在切片時出現(xiàn)碎裂現(xiàn)象。

（3）在進行染色的過程中，則需要保持在60℃加熱條件下滴加結(jié)晶紫溶液進行染色，染色液配置后需過濾去除雜質(zhì)后才可使用，染色2～3min后用水蒸餾水洗去多余染液，濾紙吸干，于60℃繼續(xù)展片干燥后即可觀察或中性樹膠封片。

參考文獻

[1]李和平.植物顯微技術[M].北京：科學出版社，2009：67-78.

[2]于紅麗，張大紅，徐夏紅，等.電鏡半薄切片制備方法的改進[J].徐州醫(yī)學院學報，2004，24（2）：129-130.

[3]楊瑞，范敬偉，劉文可，等.植物透射電鏡樣品制備技術的改進及不同樹脂選擇比較[J].北京農(nóng)學院學報，2013，28（4）：5-7.

（責編：張宏民）endprint

摘 要：以擬南芥的根和葉片為材料，對利用Spurr樹脂低粘度包埋劑進行植物樣品包埋技術進行了討論和改進。

關鍵詞：半薄切片；Spurr樹脂；技術

中圖分類號 Q81 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2014）16-16-02

半薄切片技術是將以樹脂作為包埋劑，用超薄切片機或石蠟切片機進行切片的技術。通過該技術所得到的切片厚度一般為0.5～3μm，介于超薄切片和石蠟切片之間，因而被稱為半薄切片，通常用于光學顯微鏡進行較細微組織的觀察，或用于電子顯微鏡的初步組織定位[1-2]。半薄切片的制備與電鏡超薄切片的步驟較為類似，也需要經(jīng)過固定、脫水、包埋、切片和染色等步驟，但由于其組織結(jié)構(gòu)保存較好，而且切片較薄，因此在光鏡下對于較細微組織結(jié)構(gòu)的觀察效果要比常規(guī)石蠟切片好，目前已被廣泛應用于植物各個組織的顯微結(jié)構(gòu)的觀察。

傳統(tǒng)上常采用Epon 812作為包埋劑來制備半薄切片，但由于植物細胞具有細胞壁，尤其對于根尖及種子等材料，其具有致密的細胞結(jié)構(gòu)，而Epon 812樹脂的粘度較高，因而在使用Epon 812樹脂作為包埋劑時，有時會出現(xiàn)滲透不好的問題，切片過程中出現(xiàn)空洞或破碎等現(xiàn)象；且由于Epon 812樹脂易吸潮，在濕度大的時候容易發(fā)軟，使得難以切出較好的樣品[3]。而低黏度包埋劑Spurr樹脂相對于Epon 812樹脂，具有黏度低、滲透效果好、所需聚合時間短等優(yōu)點，更適用于植物材料的包埋處理。本文利用Spurr樹脂作為包埋劑制備了擬南芥的葉及根的半薄切片，并對利用Spurr樹脂包埋制備植物半薄切片的方法及可能遇到的一些問題進行了探討。

1 材料與方法

1.1 供試材料 擬南芥成熟葉片及根。Spurr樹脂包埋試劑盒購自美國polyscience公司，由ERL4221樹脂、D.E.R736增塑劑、NSA硬化劑和DMAE催化劑4種成分組成。

1.2 實驗方法 取新鮮葉片或根用雙面刀片切成3～5mm厚的薄片或小段，放入含有4%（w/v）多聚甲醛、2%（w/v）戊二醛的50mM的二甲基砷酸鈉緩沖液（pH7.2）中，抽氣后置于4℃固定24h以上。然后用50mM的二甲基砷酸鈉緩沖液分4次，每次浸泡15min進行清洗，然后將樣品轉(zhuǎn)移至含有2%鋨酸的二甲基砷酸鈉緩沖液中放置2h進行前染色，再次用50mM的二甲基砷酸鈉緩沖液分4次，每次浸泡15min進行清洗，經(jīng)25%，50%，75%，95%和100%乙醇逐級脫水，每級不少于30min。無水乙醇脫水2h以上，并經(jīng)環(huán)氧丙烷進一步置換脫水2次，每次10～20min，將預先混合配制好的Spurr樹脂和環(huán)氧丙烷按1∶1滲透1h以上，再次用Spurr樹脂滲透樣品2h。利用小的PCR管或EP管為模具，將樣品置于樹脂中進行包埋，70℃聚合24h以上，冷卻后即可進行半薄切片。切片厚度通常為1～2μm，用睫毛筆撈片至載玻片上，加水放展片臺上60℃進行展片，并滴加0.5%結(jié)晶紫溶液進行染色。

2 結(jié)果與分析

3 討論

（1）Spurr樹脂生產(chǎn)商廠家給出的標準配方。但由于Spurr樹脂受溫度和濕度影響較大，因此，在實際應用時，應當根據(jù)氣候和工作條件的不同來調(diào)整配方。一般在北方的冬季需適當增加增塑劑的含量，而在夏季和南方等雨水較多地區(qū)則應適當增加硬化劑的含量。由于包埋試劑盒中的硬化劑NSA對水分敏感，因此混合好的樹脂應存放于密閉的干燥器中，盡量減少暴露于空氣中的時間，并盡快與材料共同轉(zhuǎn)入PCR或EP管中蓋緊蓋子進行聚合。由于Spurr樹脂中的成分可與硅膠反應，應盡量避免使用硅膠模具，防止兩者之間粘連導致包埋塊難以取出或變脆。

（2）在包埋樣品時，應根據(jù)所需進行切片的方向?qū)Σ牧衔恢眠M行調(diào)整。對于擬南芥根或葉片較為細薄的樣品，可在樣品下沿與樣品軸向垂直方向放置一根或若干根干凈的頭發(fā)絲，避免樣品過于接近包埋塊的邊緣，從而有利于修塊并防止由于過于接近包埋塊邊緣而在切片時出現(xiàn)碎裂現(xiàn)象。

（3）在進行染色的過程中，則需要保持在60℃加熱條件下滴加結(jié)晶紫溶液進行染色，染色液配置后需過濾去除雜質(zhì)后才可使用，染色2～3min后用水蒸餾水洗去多余染液，濾紙吸干，于60℃繼續(xù)展片干燥后即可觀察或中性樹膠封片。

參考文獻

[1]李和平.植物顯微技術[M].北京：科學出版社，2009：67-78.

[2]于紅麗，張大紅，徐夏紅，等.電鏡半薄切片制備方法的改進[J].徐州醫(yī)學院學報，2004，24（2）：129-130.

[3]楊瑞，范敬偉，劉文可，等.植物透射電鏡樣品制備技術的改進及不同樹脂選擇比較[J].北京農(nóng)學院學報，2013，28（4）：5-7.

（責編：張宏民）endprint