羅湘玉，羅衛(wèi)民，鄭雪松

（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院 胸心外科，湖北 十堰 442000）

穿心蓮內(nèi)酯對(duì)肺癌細(xì)胞MMP-9表達(dá)的影響及分子機(jī)制研究

羅湘玉，羅衛(wèi)民Δ，鄭雪松

（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院 胸心外科，湖北 十堰 442000）

目的觀察穿心蓮內(nèi)酯（Andrographolide， AD）對(duì)肺癌細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）表達(dá)的影響及其分子機(jī)制。方法體外培養(yǎng)肺癌細(xì)胞系H3255，分別用1．0，3．0和5．0 μmol/L AD處理細(xì)胞24 h，未處理組為空白對(duì)照。傷口愈合實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)AD對(duì)H3255細(xì)胞遷移與侵襲的影響。RT-PCR檢測(cè)MMP-9 mRNA的表達(dá)；Western blot檢測(cè)MMP-9蛋白表達(dá)和Akt磷酸化。熒光素酶報(bào)告基因分析NF-κB和MMP-9的活性。結(jié)果傷口愈合實(shí)驗(yàn)和Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AD能在不影響細(xì)胞活性的條件下顯著抑制H3255細(xì)胞侵襲和遷移。同時(shí)，Western blot和RT-PCR結(jié)果證實(shí)AD能抑制MMP-9蛋白及mRNA表達(dá)。此外，AD能抑制Akt磷酸化以及NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性。PI3 K抑制劑LY 294002處理后，NF-κB-luc活性以及MMP-9蛋白表達(dá)顯著降低。此外，不同濃度AD處理能顯著抑制MMP-9的啟動(dòng)子活性。結(jié)論AD是一種潛在的抗肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移藥物，它可能通過(guò)影響PI3 K/NF-κB通路抑制MMP-9表達(dá)而發(fā)揮作用。

穿心蓮內(nèi)酯；肺癌細(xì)胞；基質(zhì)金屬蛋白酶9

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 AD購(gòu)自Sigma-Aldrich公司（純度≥95%），并用二甲基亞砜溶解。細(xì)胞培養(yǎng)基為Invitrogen產(chǎn)品，培養(yǎng)板和Transwell小室購(gòu)自Corning。Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司。RT-PCR試劑盒購(gòu)自大連寶生物。抗MMP-9和β-actin抗體購(gòu)自Santa Cruz。磷酸化Akt，總Akt抗體購(gòu)自Cell Signaling。ECl化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自Amersham Pharmacia。NF-κB熒光素酶報(bào)告基因購(gòu)自SABioscicence，雙重?zé)晒馑孛笇?shí)驗(yàn)系統(tǒng)購(gòu)自Promega。pGL 3-basic載體和DNA轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Invitrogen。主要實(shí)驗(yàn)儀器：光測(cè)定儀(Luminometer 20/20 n，Turner BioSystems），酶標(biāo)儀（iMark，BIO-RAD），PCR 儀（Veriti，Applied Biosystems），倒置顯微鏡（TS-2000，Nicon）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) H3255細(xì)胞株購(gòu)自購(gòu)自ATCC，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基于37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)。分別設(shè)立對(duì)照組（加入等體積的DMSO）及不同濃度AD處理組（分別加入終濃度為1.0，3.0，5.0 μmol/L的AD作用24 h）。采用MTT觀察AD對(duì)H3255細(xì)胞的增殖情況，即H3255孵育結(jié)束后，每孔加入30 μL MTT溶液（1 mg/mL）孵育2 h。棄上清，并加入200 μL DMSO，充分混勻，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的吸光度值（OD 570），并計(jì)算抑制率。抑制率=（對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值）/對(duì)照組OD值×100%。

1.3 RT-PCR檢測(cè)MMP-9 mRNA表達(dá) 采用Trizol提取RNA，并根據(jù)試劑盒提供的步驟進(jìn)行RTPCR。PCR反應(yīng)條件如下：94℃變性 30 s，65℃（MMP-9）或 59℃（GAPDH）30 s，72℃延伸 30 s。隨后進(jìn)入 40（MMP-9）或35（GAPHD）個(gè)擴(kuò)增循環(huán)。其中MMP-9引物分別為5’-CGCTACCACCTCGAACTTTG-3’和 5’-GCCATTCAC GTCGTCCTTAT-3’，產(chǎn)物 196 bp。GAPDH：5’-TCACCAT CTTCCAGGAGCGA-3’，5’-CACAATGCCGAAGT GGTCGT-3’，產(chǎn)物700 bp。擴(kuò)增產(chǎn)物隨后經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，并采用Image J軟件進(jìn)行灰度分析并計(jì)算2者比值。

1.4 傷口愈合實(shí)驗(yàn) 通過(guò)傷口愈合實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞的遷移能力。將5×106細(xì)胞接種于6孔板中37℃培養(yǎng)6 h。待細(xì)胞呈單層貼壁生長(zhǎng)后，用200 μL的移液管尖端在板上劃痕。PBS洗滌后加入含有AD的完全培養(yǎng)基孵育24 h。在顯微鏡下拍照并計(jì)算遷移率：（1-處理后劃痕距離/對(duì)照組劃痕距離）×100%。

1.5 侵襲性實(shí)驗(yàn) 將基質(zhì)膠均勻鋪至Transwell小室上室，并加入100 μL細(xì)胞懸液（106/mL），下室加入500 μL完全培養(yǎng)基，37℃孵育24 h。取出Transwell，多聚甲醛固定，風(fēng)干后加入0.1%結(jié)晶紫染色20 min。擦除上室細(xì)胞，顯微鏡下隨機(jī)選擇視野拍照，計(jì)算遷移到下腔表面的細(xì)胞數(shù)。其中侵襲抑制率=（1-樣本穿膜細(xì)胞數(shù)/對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.6 Western blot 根據(jù)試劑盒提供的步驟提細(xì)胞總蛋白并測(cè)定其濃度。獲取100 μg蛋白用于SDS-PAGE。分離的總蛋白或核蛋白隨后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上（Millipore），并利用含5%脫脂牛奶的TBST封閉1 h，隨后加入抗MMP-9或抗Akt抗體4℃孵育過(guò)夜。多次洗滌之后，加入HRP標(biāo)記的抗體孵育1 h。ECL法（Amersham）發(fā)光、顯影。

1.7 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和熒光素酶報(bào)告基因分析 從Genebank獲取MMP-9基因啟動(dòng)子序列（上游720 bp～11 bp），采用PCR方法將其克隆至pGL 3-basic載體上，構(gòu)建pGL 3-MMP-9-luc報(bào)告基因質(zhì)粒。生長(zhǎng)于6孔板中的6 H 3255細(xì)胞隨后共轉(zhuǎn)入0.2 μg pGL 3-MMP-9-luc（或NF-κB-luc）質(zhì)粒，以及0.2 μg pSV-β-半乳糖苷酶質(zhì)粒。隨后細(xì)胞加入不同濃度AD作用24 h。采用雙重?zé)晒馑孛笀?bào)告系統(tǒng)（Promega）計(jì)算螢光素酶活性的相對(duì)值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，正態(tài)計(jì)量數(shù)據(jù)用“±s”表示，并采用單因素方差分析方法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AD抑制H3255細(xì)胞的遷移和侵襲 為了觀察AD對(duì)H 3255侵襲和遷移的影響，首先應(yīng)確定AD的最大作用濃度。MTT結(jié)果顯示，1.0～5.0μmol/L AD處理對(duì)細(xì)胞的活性無(wú)明顯影響（結(jié)果未顯示）。傷口愈合實(shí)驗(yàn)顯示：1.0，3.0，5.0μmol/L AD處理H3255細(xì)胞后，細(xì)胞遷移率分為為（67.07±4.27）%，（49.82±3.71）%和（37.08±2.74）%，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Transwell結(jié)果顯示，不同濃度的AD也能呈劑量依賴(lài)性方式抑制H3255細(xì)胞侵襲（見(jiàn)表1）。

2.2 AD抑制H3255細(xì)胞MMP-9蛋白及mRNA表達(dá)RT-PCR結(jié)果顯示，H3255細(xì)胞未處理前，MMP-9 mRNA表達(dá)水平較高，經(jīng)不同濃度AD處理后，其mRNA水平隨著濃度的增高而降低（見(jiàn)圖 1 A）。Western blot結(jié)果也顯示，1.0～5.0 μmol/L AD處理后，MMP-9蛋白含量逐漸降低（見(jiàn)圖1 B）。

圖1 AD對(duì)MMP-9 mRNA（A）與蛋白（B）表達(dá)的影響1. 對(duì)照組；2. 1.0μmol/L AD組；3. 3.0μmol/L AD組；4. 5.0μmol/L AD組Fig.2 Effect of AD on the mRNA expression (A) andprotein expression (B) of MMP-91. Control；2. 1.0μmol/L AD group；3. 3.0μmol/L AD group；4. 5.0μmol/L AD group

2.3 AD抑制PI3 K/NF-κB通路的活性 Western blot結(jié)果顯示，AD處理后，H 3255細(xì)胞中磷酸化Akt水平明顯降低，而總Akt無(wú)明顯影響（見(jiàn)圖2A）。此外，報(bào)告基因結(jié)果顯示，AD也能影響NF-κB-luc的轉(zhuǎn)錄活性，同時(shí)，采用20 μmol/L PI3 K抑制劑LY 294002處理后，NF-κB-luc活性顯著降低（見(jiàn)圖2B）。

圖2 AD對(duì)H3255細(xì)胞PI3K磷酸化（A）及NF-κB活性（B）的影響1. 對(duì)照組；2. 1.0μmol/L AD組；3. 3.0μmol/L AD組；4. 5.0μmol/L AD組； 5. 20μmol/L LY294002*P＜0.05，與對(duì)照組相比Fig.2 Effect of AD on PI3K phosphorylation (A) and NF-κB activity (B) in H3255 cells1. Control；2. 1.0μmol/L AD group；3. 3.0μmol/L AD group；4. 5.0μmol/L AD group；5. 20μmol/L LY294002*P＜0.05，compared with control group

2.4 AD經(jīng)PI3 K/NF-κB抑制MMP-9的表達(dá)與轉(zhuǎn)錄 Western blot顯示，PI3 K抑制劑LY 294002和NF-κB抑制劑PDTC處理H3255細(xì)胞后，MMP-9表達(dá)顯著降低（見(jiàn)圖3A）。此外，報(bào)告基因顯示，不同濃度AD處理能顯著抑制MMP-9的啟動(dòng)子活性，從而抑制MMP-9的轉(zhuǎn)錄（見(jiàn)圖3B）。

圖3A PI3K和NF-κB抑制劑對(duì)MMP-9蛋白表達(dá)的影響1. 陰性對(duì)照；2. 20μmol/L LY294002；3. 20 μmol/L PDTCFig.3A Effect of PI3K and NF-κB inbitors on MMP-9 protein expression1. Control；2. 20μmol/L LY294002；3. 20μmol/L PDTC

圖3B AD對(duì)MMP-9轉(zhuǎn)錄活性的影響1. 對(duì)照組；2. 1.0μmol/L AD；3. 3.0μmol/L AD；4. 5.0μmol/L AD；*P＜0.05，與對(duì)照組相比Fig.3B Effect of AD on MMP-9 transcriptional activity1. Control； 2. 1.0μmol/L AD；3. 3.0μmol/L AD；4. 5.0μmol/L AD*P＜0.05，compared with control

3 討論

對(duì)于肺癌而言，癌細(xì)胞的局部侵潤(rùn)以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是患者治療失敗和死亡的首要原因。癌細(xì)胞在侵潤(rùn)性生長(zhǎng)過(guò)程中，ECM的降解是癌細(xì)胞從原發(fā)部位脫落，并經(jīng)淋巴結(jié)或血液轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵[8]。而MMP-9在其中發(fā)揮至關(guān)重要作用[9]。因此，預(yù)防或抑制癌細(xì)胞侵潤(rùn)和轉(zhuǎn)移在很大程度上可提高癌癥患者的生存率。有研究顯示：AD能抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[10-11]；然而，AD對(duì)肺癌的抑制作用尚未完全清楚。本研究證實(shí)AD在無(wú)細(xì)胞毒性的濃度范圍內(nèi)能明顯抑制H 3255細(xì)胞的侵潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，并能明顯抑制明膠酶活性和MMP-9的表達(dá)，這表明AD在肺癌中通過(guò)抑制MMP-9的表達(dá)和活性而具有抗侵襲的潛能。

PI3 K是一種脂質(zhì)激酶，通過(guò)激活A(yù)kt（蛋白激酶B）控制多種生理過(guò)程，它通過(guò)誘導(dǎo)P 21 WAF1定位于細(xì)胞質(zhì)，并通過(guò)滅活前凋亡因子BAD和caspase-9發(fā)揮抗凋亡作用；此外，活化的Akt可通過(guò)誘導(dǎo)MMPs的表達(dá)而促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移[12]。研究顯示，MMP-9 mRNA含量與PI3 K的活性成正相關(guān)[13]。本研究也證實(shí)，AD能抑制PI3 K產(chǎn)物Akt磷酸化，從而抑制MMP-9的表達(dá)。NF-κB是Akt下游通路的重要靶分子。并參與調(diào)控MMP-9的表達(dá)，并與炎癥、腫瘤細(xì)胞增殖、侵潤(rùn)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[14]。此外，NF-κB在多種腫瘤細(xì)胞中持續(xù)激活，并誘導(dǎo)多種抗凋亡蛋白表達(dá)而導(dǎo)致化療/放療耐受[15]。因此抑制NF-κB的活性可能有利于提高藥物的療效。本研究結(jié)果顯示，AD可有效抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄活性。由于MMP-9的啟動(dòng)子區(qū)域存在NF-κB的結(jié)合位點(diǎn)[16]，因此本研究構(gòu)建了MMP-9啟動(dòng)子序列的報(bào)告基因，結(jié)果也證實(shí)，AD可通過(guò)影響PI3 K/NF-κB的活性，從而抑制MMP-9的轉(zhuǎn)錄激活作用。

綜上所述，本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證明AD具有抑制H3255細(xì)胞侵潤(rùn)的能力。其機(jī)制可能通過(guò)抑制PI3 K/ NF-κB信號(hào)通路，最終下調(diào)MMP-9的活性及表達(dá)有關(guān)。這表明AD可能是一種富有前途的抗癌輔助藥物。盡管如此，但其在體內(nèi)的分布以及轉(zhuǎn)運(yùn)仍不清楚，此外，不同的腫瘤細(xì)胞，對(duì)AD的敏感性也可能有所不同。在隨后的研究中，我們將通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)其安全性和代謝動(dòng)力學(xué)等方面開(kāi)展更進(jìn)一步研究。

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Effect of andrographolide on MMP-9 expression in lung cancer cell and its molecular mechanism

LUO Xiang-yu, LUO Wei-minΔ, ZENG Xue-song

(Department of Cardiothoracic Surgery，Hubei University of Medicine Affiliated Taihe Hospital of Shiyan, Shiyan 442000, China)

ObjectiveTo investigate the effect and molecular mechanism of Andrographolide (AD) on matrix metalloproteinase-9 (MMP-9)expression in human colon cancer H3255 cells.MethodsHuman lung cancer H3255 cell line weve cultured in vitro, and treated with 1.0, 3.0, 5.0 μmol/L AD for 24 h, untreated cells were used as blank control. Cell viability, cell migration and cell invasion were analyzed by MTT assay, scratch healing assay and transwell membrane assay, respectably. Expression of MMP-9 mRNA was analyzed by RT-PCR. Protein expression and phosphorylation of Akt were detected by Western blot. Activity of NF-κB and MMP-9 were analyzed by luciferase reporter assay.ResultsAD could significantly reduced H 3255 cells invasion and migration without affecting the viability of cells, as demonstrated by scratch healing and transwell membrane assay. Furthermore,Western blot and RT-PCR results showed that AD could markedly inhibited MMP-9 activity and its expression in both protein and mRNA levels. AD could attenuated Akt’s phosphorylation and the activity of NF-κB. Moreover, LY 294002, an inhibitor of PI3 K, could significantly inhibited NF-κB transcriptional activity and MMP-9 expression. In addition, different concentrations of AD could inhibit the promote activity of MMP-9.ConclusionAD was a potential anti-invasive agent by inhibiting MMP-9 involved in PI3 K/NF-κB pathways.

Andrographolide; human lung cancer cells; matrix metalloproteinase-9

R 734．2

A

1005-1678(2014)02-0013-04

肺癌是各類(lèi)癌癥死亡的首位。尤其是非小細(xì)胞肺癌（non small cell lung cancer，NSCLC）最常見(jiàn)（占肺癌總數(shù)的 80%以上）[1]。肺癌起病隱匿，90%以上患者死于癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[2]。在此過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶脫落，并降解細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix， ECM）是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的最重要病理生理改變，而此過(guò)程與基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）的活性密切相關(guān)[3-4]。因此，以MMPs為研究靶點(diǎn)，探索抑制MMPs活性的治療藥物，對(duì)肺癌的治療具有重要意義。

穿心蓮內(nèi)酯（Andrographolide，AD）是我國(guó)傳統(tǒng)中草藥穿心蓮中提取出來(lái)的一類(lèi)二萜類(lèi)化合物。它通常作為一種消炎解毒藥物用于治療各種感染性疾病[5]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，AD除了傳統(tǒng)的抗病毒作用外，也具有抗腫瘤的潛能[6-7]。盡管如此，但AD能否影響肺癌細(xì)胞的遷移與侵襲目前仍不清楚。本研究旨在觀察AD對(duì)肺癌H3255細(xì)胞的遷移與侵襲有何影響，并探討其可能的調(diào)控機(jī)制。

國(guó)家自然科學(xué)基金（81372984）

羅湘玉，女，副主任護(hù)師，研究方向：心肺疾病的防治研究，E-mail：xiangyu_luo@126.com；羅衛(wèi)民，通信作者，男，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：胸心外科疾病的診斷與治療，E-mail: weiminluo@163.com。