付桂莉，鄭源泉，盧靜靜，黃美蓮，李延

(1.武漢市兒童醫(yī)院 皮膚科，湖北 武漢 430016；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院 皮膚科，湖北 武漢 430022)

香菇多糖對平陽霉素抑制血管內(nèi)皮瘤細(xì)胞增殖的影響

付桂莉1，鄭源泉1，盧靜靜1，黃美蓮1，李延2

(1.武漢市兒童醫(yī)院 皮膚科，湖北 武漢 430016；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院 皮膚科，湖北 武漢 430022)

目的研究香菇多糖對平陽霉素抑制血管內(nèi)皮瘤細(xì)胞的增殖的影響。方法將EOMA小鼠血管內(nèi)皮瘤細(xì)胞分別單用香菇多糖處理（LTN組）、單用平陽霉素處理（BLE組）、香菇多糖聯(lián)合平陽霉素處理（L+B組）和未做任何處理（CON組），比較4組細(xì)胞處理前后細(xì)胞增殖和凋亡的差異。結(jié)果 CON組和LTN組作用后d 1-d 7的吸光度無顯著差異，但均顯著高于BLE組和L+B組（P＜0．05）；L+B組作用后d 1-d7的吸光度顯著低于BLE組（P＜0．05）。BLE組和 L+B組 G 0/G1期和凋亡率顯著高于 CON組和 LTN組（P＜0．05），S期、G 2/M期和 PI顯著低于 CON組和 LTN組（P＜0．05）；L+B組G 0/G1期和凋亡率顯著高于BLE組（P＜0．05），S期、G 2/M期和PI顯著低于BLE組（P＜0．05）。結(jié)論香菇多糖可顯著增強(qiáng)平陽霉素對小鼠血管內(nèi)皮瘤細(xì)胞抑制增殖及促進(jìn)凋亡的作用。

血管瘤；平陽霉素；香菇多糖；細(xì)胞增殖；凋亡

香菇多糖是臨床上廣泛應(yīng)用的抗腫瘤藥物，其作用機(jī)制與提高機(jī)體T淋巴細(xì)胞免疫和細(xì)胞毒性T細(xì)胞的殺傷作用有關(guān)，而香菇多糖自身對腫瘤細(xì)胞無直接抑制作用[1-2]。平陽霉素是由博萊霉素類抗腫瘤抗生素，能抑制腫瘤細(xì)胞DNA的合成，影響腫瘤細(xì)胞代謝，對多種腫瘤細(xì)胞具有殺滅作用[3-4]。本研究采用香菇多糖聯(lián)合平陽霉素處理血管內(nèi)皮瘤細(xì)胞，探討香菇多糖體外對平陽霉素抑制血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 EOMA小鼠血管內(nèi)皮瘤細(xì)胞購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心，胎牛血清和DMEM購自Gibco公司，MTT試劑購自碧云天公司，香菇多糖購自南京康海藥業(yè)有限公司，平陽霉素購自天津太河制藥有限公司（國藥準(zhǔn)字：H12020933）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和藥物處理 EOMA小鼠血管內(nèi)皮瘤細(xì)胞完全培養(yǎng)基為10%胎牛血清和90%DMEM，培養(yǎng)在37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱。香菇多糖經(jīng)DMEM配制成1μmol/mL處理液，平陽霉素用生理鹽水配制成1 mg/mL處理液。根據(jù)藥物處理EOMA小鼠血管內(nèi)皮瘤細(xì)胞方法分成CON組（僅完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，未加入香菇多糖和平陽霉素）、LTN組（僅加入香菇多糖，香菇多糖終濃度0.1 μmol/L）、BLE組（僅加入平陽霉素，平陽霉素終濃度0.1 mg/mL）和L+B組（加入香菇多糖和平陽霉素，香菇多糖終濃度0.1 μmol/L，平陽霉素終濃度0.1 mg/mL）。4組細(xì)胞藥物處理24 h后PBS清洗3次，完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，檢測其增殖和凋亡。

1.3 檢測指標(biāo)及方法，細(xì)胞增殖：采用MTT法檢測，檢測處理前（d 0）和處理d 1～d 7后酶標(biāo)檢測儀檢測490 nm下的吸光值（A）并繪制細(xì)胞增殖曲線；細(xì)胞周期和凋亡：采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡，增殖指數(shù)（PI）=（S+G 2/M）/（G0/G1+S+G2/M）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。正態(tài)計(jì)量資料采用“±s”表示。4組間均數(shù)兩兩比較采用Student-Newman-Keuls法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖比較結(jié)果 4組EOMA小鼠血管內(nèi)皮瘤細(xì)胞藥物作用前吸光度無明顯差異，藥物處理后4組細(xì)胞d 1-d 7吸光度逐漸升高；CON組和LTN組作用后d 1-d 7的吸光度無顯著差異，但均顯著高于BLE組和L+B組（P＜0.05）；L+B組作用后d 1-d 7的吸光度顯著低于BLE組（P＜0.05，見圖1）。

圖1 4組EOMA小鼠血管內(nèi)皮瘤細(xì)胞d 0～d 7吸光值Fig.1 Absorbance of EOMA cells in d 0～d 7 after treatment in four groups*P＜0.05，與CON組和LTN組相比，compared with CON group and LTN group；﹟P＜0.05，與 BLE 組對比，compared with BLE group

2.2 細(xì)胞周期和凋亡比較 CON組和LTN組EOMA小鼠血管內(nèi)皮瘤細(xì)胞G0/G1期、S期、G2/M期、PI和凋亡率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；BLE組和L+B組G0/G1期和凋亡率顯著高于CON組和LTN組（P＜0.05），S期、G2/M期和PI顯著低于CON組和LTN組（P＜0.05）；L+B組G0/G1期和凋亡率顯著高于BLE組（P＜0.05），S期、G2/M期和PI顯著低于BLE組（P＜0.05）（見表 1）。

表1 4組EOMA小鼠血管內(nèi)皮瘤細(xì)胞細(xì)胞周期和凋亡對比（%）Tab.1 Comparision of cell cycle, PI and apoptosis rates in EOMA cells among four groups(%)

3 討論

平陽霉素是平陽鏈霉菌產(chǎn)生的博萊霉素類抗腫瘤抗生素，能抑制腫瘤細(xì)胞DNA的合成，影響腫瘤細(xì)胞代謝，促進(jìn)癌細(xì)胞變性、壞死，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明平陽霉素肝癌、消化道腫瘤和血管瘤等腫瘤細(xì)胞均有較強(qiáng)的殺滅作用[5-7]。平陽霉素為細(xì)胞周期非特異性藥物，研究表明平陽霉素產(chǎn)生的OH-與DNA結(jié)合，抑制DNA復(fù)制，將細(xì)胞阻滯在G0/G1期和S期，這種抑制作用呈劑量依賴性[8-9]。平陽霉素的抗腫瘤作用還與其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)，高濃度的平陽霉素可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞啟動(dòng)程序性死亡程序。香菇多糖是典型的T細(xì)胞激活劑，在臨床上廣泛應(yīng)用于各種腫瘤的治療，可顯著提高抗腫瘤藥物的療效并降低其不良反應(yīng)，因香菇多糖自身對腫瘤細(xì)胞無直接殺滅作用，故目前對香菇多糖在體外中能否增強(qiáng)抗腫瘤藥物對腫瘤細(xì)胞的殺滅作用尚存在極大爭議。本研究中，L+B組EOMA小鼠血管內(nèi)皮瘤細(xì)胞d 1-d 7的吸光度顯著低于BLE組（P＜0.05），而G0/G1期和凋亡率顯著高于BLE組（P＜0.05），S 期、G2/M期和 PI顯著低于 BLE 組（P＜0.05），證實(shí)平陽霉素對腫瘤細(xì)胞增殖抑制及促進(jìn)凋亡作用，同時(shí)表明體外實(shí)驗(yàn)中香菇多糖可增強(qiáng)平陽霉素對腫瘤細(xì)胞的殺滅作用。

本研究中，CON組和LTN組作用后d 1～d 7的吸光度、G0/G1期、S期、G2/M期、PI和凋亡率無明顯差異，證實(shí)香菇多糖自身對腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡無明顯作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明香菇多糖通過改善機(jī)體免疫功能而增強(qiáng)抗腫瘤藥物的抗腫瘤作用，而在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中無體內(nèi)免疫環(huán)境，故香菇多糖體外增強(qiáng)化療藥物的抗腫瘤作用可能存在其他作用機(jī)制[10]。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明香菇多糖可抑制腫瘤細(xì)胞耐藥基因的表達(dá)，從而增加腫瘤藥物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的濃度[11]。目前發(fā)現(xiàn)耐藥基因包括多藥耐藥基因（multidrug resistance gene 1，MDR 1）、多藥耐藥相關(guān)蛋白（multidrug resistance protein，MRP）和肺耐藥蛋白（lung resistance protein，LRP），MDR可利用ATP水解功能將抗腫瘤藥物泵出胞膜外；MRP可將帶負(fù)電荷的藥物分子逆濃度泵出到細(xì)胞外，降低抗腫瘤藥物在細(xì)胞內(nèi)的濃度，同時(shí)改變細(xì)胞內(nèi)的pH值，抑制抗腫瘤藥物與靶點(diǎn)的結(jié)合；LRP可阻止抗腫瘤藥物進(jìn)入細(xì)胞核，還可將進(jìn)入胞漿的抗腫瘤藥物轉(zhuǎn)運(yùn)到運(yùn)輸囊泡中，通過胞吐的方式排出細(xì)胞外[12-13]。體內(nèi)外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，腫瘤細(xì)胞存在原發(fā)耐藥基因表達(dá)，采用大劑量平陽霉素可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞MRP和P-gp表達(dá)增加從而產(chǎn)生耐藥性，而逆轉(zhuǎn)耐藥基因表達(dá)后可增強(qiáng)平陽霉素對其的殺滅作用[14-15]?；谶@些證據(jù)，推測本研究中香菇多糖是通過降低耐藥基因的表達(dá)從而提高平陽霉素對血管內(nèi)皮瘤細(xì)胞的抑制增殖和促進(jìn)凋亡作用。

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Effects of lentinan on bleomycin A5’s inhibition effects in hemangioma-derived endothelial cell

FU Gui-li1, ZHENG Yuan-quan1, LU Jing-jing1, HUANG Mei-lian1, LI Yan2

(1.Department of Dermatology, Wuhan Children's Hospital, Wuhan 430016,China; 2.Department of Dermatology, Union Hospital, Tongji Medical college, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022,China)

ObjectiveTo study the effects of Lentinan on bleomycin A5’s inhibition effects in hemangioma-derived endothelial cell.MethodsHemangioma-derived endothelial cell line EOMA were divided into LTN group (only lentinan treatment), BLE group (only bleomycin A 5 treatment),L+B group (Lentinan and bleomycin A5 treatment) and CON group (no lentinan and bleomycin A5 treatment). Cell proliferation, cell cycle, PI and apoptosis were detected and compared among four groups.ResultsThe differences of absorbance in LBE group was significantly higher than that in L+B group after treatment for d 1-d 7 (P＜0.05), but both of them were significantly lower than in CON group and LTN group (P＜0.05). The G 0/G 1 stage and apoptosis rate in L+B group was significantly higher than in BLE group(P＜0.05), while it was significantly lower in S stage, G 2/M stage and PI(P＜0.05).ConclusionLentinan could significantly enhance bleomycin A5’s inhibition effects on hemangioma-derived endothelial cell.

hemangioma; bleomycin A5; lentinan; cell proliferation; apoptosis

R 735

A

1005-1678(2014)02-0020-02

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金（30901287）

付桂莉，女，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：兒童皮膚疾病診斷與治療，E-mail：157047064@qq.com。