徐春華 劉越 肖利民 鄧圣澤 李東海

隨著分子生物學(xué)及相關(guān)學(xué)科的發(fā)展，腫瘤的基因療法倍受關(guān)注，其中自殺基因療法顯示了較好的應(yīng)用前景，HSV-TK/GCV系統(tǒng)是目前研究較為廣泛的自殺基因治療系統(tǒng)，研究表明，單一基因治療效果不佳，而自殺基因與免疫治療相結(jié)合是研究發(fā)展的趨勢(shì)，可增強(qiáng)旁殺傷作用和激發(fā)腫瘤局部的免疫反應(yīng)[1-2]。所以為了研究腺病毒載體介導(dǎo)的單純皰疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）與細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-18（IL-18）基因聯(lián)合應(yīng)用對(duì)C6鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的治療效果，本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)構(gòu)建含TK及IL-18基因的重組腺病毒載體，為腫瘤的基因治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 （1）細(xì)胞株與質(zhì)粒：PVA腺病毒載體 pAdtrackCMV、pAdEasy-1、大腸桿菌 E.coli，293細(xì)胞。（2）試劑：限制性內(nèi)切酶XbaI、Kpn、Pme I、EcoR I、ExTaqDNA聚合酶、T4DNA連接酶、DNA凝膠回收試劑盒、堿性磷酸酶CIAP、DNA提取試劑盒等均購(gòu)自TaKaRa公司；胰蛋白酶，小牛血清，DMEM，Polybrene，DMSO為Sigma公司產(chǎn)品；脂質(zhì)體LipofectamineTM2000、DNA Ladder：Invitrogen公 司 膠回收小量試劑盒購(gòu)自上海華舜生物工程有限公司；中量質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司。

1.2 方法 通過(guò)在NCBI上的檢索，在Gene Bank數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取基因IL-18、TK的全長(zhǎng)序列，引物由ABI公司的Primer Express Software v 2.0設(shè)計(jì)，由invitrogen公司合成。擴(kuò)增IL-18及TK基因，IL-18引物序列：上游：5’-cacGGTACCATGGCTGCTGAACCAGTAGAAG T-3’下游：5’-gcTCTAGACTAGTCTTCGTTTTGAACAG TGAA-3’，預(yù)計(jì)長(zhǎng)度：582 bp；TK 引物序列：上游：5’-cacGGTACCATGAGCTGCATTAACCTGCCCAC-3’， 下游：5’-gcTCTAGATCAGTTGGCAGGGCTGCATTGCAG AATC-3’，預(yù)計(jì)長(zhǎng)度：705 bp。經(jīng)各自反應(yīng)條件后，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳，回收DNA片段。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，鋪瓊脂板后，37 ℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10~12 h。挑取含有目的基因的候選克隆，采用DNA重組技術(shù)，構(gòu)建AdCMV-TK及AdCMV-IL-18。

1.3 AdCMV-TK與AdCMV-IL-18的PCR鑒定 分別將AdCMV-TK及AdCMV-IL-18重組腺病毒液2 mL感染80%融合的293細(xì)胞，待單層細(xì)胞大部分變圓但尚未脫落時(shí)收集細(xì)胞，反復(fù)凍融3次，取少許提取腺病毒DNA，進(jìn)行PCR鑒定，并以一個(gè)目的基因不同的重組病毒為陽(yáng)性對(duì)照，采用純水作為陰性對(duì)照。鑒定引物：上游：5’-ACCAAGGAAATCGGCCTCTAT-3’，下游：5’-GCCATACCTCTAGGCTGGCTAT -3’，預(yù)計(jì)長(zhǎng)度：115 bp；TK引物序列：上游：5’-TGCATTAACCTGCCCACTGT-3’，下游：5’-AAAACTGCCCCTCGTCGAT-3’，預(yù)計(jì)長(zhǎng)度：298 bp。

1.4 制備并純化高滴定度腺病毒 回合1：從初級(jí)轉(zhuǎn)染溶胞產(chǎn)物放大：干冰/甲醇浴冷凍細(xì)胞，37 ℃水浴解凍循環(huán)4次以從細(xì)胞釋放病毒。用清潔的溶胞產(chǎn)物進(jìn)行下一回合的放大或-80 ℃保存。回合2和3：中等規(guī)模的放大后；原種儲(chǔ)存于-80 ℃。OD260檢測(cè)病毒滴度。測(cè)量OD260時(shí)，加15 μL病毒和15 μL空白溶液至100 μL TE/0.1%SDS，旋轉(zhuǎn)30 s，離心5 min，測(cè)量。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增TK及IL-18基因產(chǎn)物的電泳結(jié)果 從圖1中分析，擴(kuò)增的條帶與預(yù)期的大小相符，說(shuō)明得到的正是目的條帶（TK：705 bp；IL-18：582 bp）。

2.2 重組腺病毒TK及IL-18的PCR鑒定 PCR電泳顯示特異性預(yù)計(jì)大小的片段，證明重組腺病毒含有TK基因及 IL-18基因，見(jiàn)圖 2~3（TK：298 bp；IL-18：115 bp）。

圖1 PCR擴(kuò)增目的基因的瓊脂糖凝膠電泳

圖2 AdCMV-TK的PCR鑒定

圖3 AdCMV-IL-18的PCR鑒定

2.3 病毒滴度的測(cè)定 測(cè)得重組腺病度滴度為：AdCMV-TK=1.28×109PFU/mL， AdCMV-IL-18=1.28×109PFU/mL。

3 討論

在現(xiàn)代分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)飛速發(fā)展的推動(dòng)下，腫瘤的生物學(xué)治療日益受到人們的重視，顯示出良好的應(yīng)用前景?；蛑委熓巧飳W(xué)治療的一個(gè)重要組成部分，有效的基因治療依賴于外源基因在受體中高效、穩(wěn)定的表達(dá)，而這在很大程度上取決于基因治療所采用的載體系統(tǒng)，基因治療多為病毒性載體，常見(jiàn)的病毒性載體如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、慢病毒等，而以腺病毒為載體的治療在基因治療研究中應(yīng)用廣泛[3-4]。

腺病毒是一種無(wú)包膜的線狀雙鏈DNA病毒，在體內(nèi)療法的基因轉(zhuǎn)移中具有很大的優(yōu)勢(shì)[5-6]，由于其感染細(xì)胞時(shí)DNA不整合到宿主染色體上，不存在激活致癌基因或插入突變等危險(xiǎn)，制備容易，操作簡(jiǎn)單。腺病毒載體具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）人類是腺病毒的自然宿主，因此較為安全；（2）靶細(xì)胞范圍廣，它不但能感染復(fù)制分裂細(xì)胞，也能感染非分裂細(xì)胞，并且能介導(dǎo)體內(nèi)多種組織的基因轉(zhuǎn)移，如肺、腦、神經(jīng)系統(tǒng)等；（3）滴度高，可達(dá)1011~1012PFU/mL；（4）可在腸道內(nèi)及呼吸道內(nèi)繁殖，它的重組病毒可由靜脈注射、腸道吸收或氣管內(nèi)滴注等多類方式給予，以達(dá)到有效的基因轉(zhuǎn)移和治療；（5）該載體沒(méi)有包膜，不容易被其補(bǔ)體所滅活，可直接在體內(nèi)使用[7-8]。但載體也有不足之處：（1）基因轉(zhuǎn)移缺乏特異性；（2）載體是一種非整合載體，對(duì)于非分裂相細(xì)胞，其介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移可持續(xù)表達(dá)幾個(gè)月，但對(duì)于增殖旺盛的細(xì)胞，要達(dá)到長(zhǎng)期的基因表達(dá)，則需重復(fù)給予；（3）重復(fù)給予時(shí)機(jī)體可能產(chǎn)生免疫應(yīng)答，影響基因表達(dá)和治療效果。

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)惡性腫瘤，約占全部中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的45%~55%，傳統(tǒng)的手術(shù)、放療及化療等聯(lián)合治療效果不理想，低級(jí)別膠質(zhì)瘤患者平均生存3~5年，而高級(jí)別膠質(zhì)瘤則為1~2年[8-10]。自殺基因治療在膠質(zhì)瘤的基因治療中占有極為重要的地位，自殺基因療法是指將某些病毒的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，此基因編碼的特異性酶類能將細(xì)胞無(wú)毒或毒性極低的藥物前體在腫瘤細(xì)胞內(nèi)代謝成細(xì)胞毒性產(chǎn)物，以達(dá)到殺死腫瘤細(xì)胞為目的[11]。研究發(fā)現(xiàn)，只要少量的自殺基因轉(zhuǎn)染的癌細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染的癌細(xì)胞按一定比例混合后共同培養(yǎng)，不僅轉(zhuǎn)染的癌細(xì)胞被殺滅，二者相互接觸后相鄰的未轉(zhuǎn)染的癌細(xì)胞也大量死亡，即“旁觀者效應(yīng)”[12-14]。但是自殺基因治療不能有效地激發(fā)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，機(jī)體免疫反應(yīng)是自殺基因旁觀者效應(yīng)的主要因素，免疫基因治療雖可提高腫瘤細(xì)胞的免疫原性，誘導(dǎo)機(jī)體的抗腫瘤免疫應(yīng)答，但直接殺傷腫瘤作用不強(qiáng)，因此可將自殺基因及免疫基因治療聯(lián)合應(yīng)用以增強(qiáng)療效[15]。

本實(shí)驗(yàn)為研究HSV-TK與IL-18基因聯(lián)合應(yīng)用對(duì)C6鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑瘤效果，進(jìn)行了前期重組腺病毒的構(gòu)建和鑒定工作，結(jié)果顯示：通過(guò)采用腺病毒作為載體，經(jīng)DNA重組技術(shù)，成功構(gòu)建了重組腺病毒AdCMV-TK及AdCMV-IL-18，病毒滴度高，均為1.28×109PFU/mL，為今后腫瘤基因治療的體內(nèi)外進(jìn)一步研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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