倪陽，崔毓桂

（1.浙江省中醫(yī)院 藥劑科，浙江 杭州 310006；2.南京醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)科學(xué)部，江蘇 南京 210029）

復(fù)方大血藤對丙酸睪酮所致小鼠前列腺增生的防治作用

倪陽1，崔毓桂2

（1.浙江省中醫(yī)院 藥劑科，浙江 杭州 310006；2.南京醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)科學(xué)部，江蘇 南京 210029）

目的研究復(fù)方大血藤（complex of daxueteng，CDXT）對前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH）的防治作用，并探討其可能的作用機制。方法取昆明種小鼠60只隨機分成6組，即對照組、模型組、CDXT低（0.225 g／kg）、中（0.45 g／kg）、高劑量組（0.9 g／kg）、陽性對照組（QLBETS，0.67 g／kg）。于昆明種雄性小鼠皮下注射丙酸睪酮溶液復(fù)制BPH動物模型，用CDXT進行治療，觀察該藥對小鼠前列腺增生的防治作用及對前列腺組織形態(tài)的影響，并用免疫組化法檢測前列腺組織中雄激素受體（AR）的表達。結(jié)果對丙酸睪酮所致小鼠BPH，CDXT可降低小鼠前列腺指數(shù)，抑制前列腺上皮組織增生、腺體增生及間質(zhì)纖維組織增生，改善BPH小鼠前列腺細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，并降低前列腺組織中AR的表達。結(jié)論CDXT對前列腺增生具有較好的防治作用，可抑制前列腺上皮組織增生、腺體增生及間質(zhì)纖維組織增生，改善BPH小鼠前列腺細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，其作用機制可能與降低前列腺組織中AR的表達有關(guān)。

復(fù)方大血藤；前列腺增生；雄激素受體

大量研究表明中醫(yī)藥在治療前列腺增生方面具有獨特優(yōu)勢，能有效緩解臨床癥狀、改善患者生活質(zhì)量［5-7］。本實驗采用小鼠皮下注射丙酸睪酮建立小鼠BPH模型，觀察CDXT對前列腺炎及BPH的作用，并探討其可能的作用機制，為其臨床應(yīng)用提供藥理學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 60只昆明種雄性小鼠，體質(zhì)量29～31 g，由貴陽醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，合格證號 SCXK（黔）2002-0001。

1.2 藥物與試劑 復(fù)方大血藤由貴州省貴定縣胡三帖藥業(yè)有限公司提供，每毫升藥液含生藥0.1 g；前列閉爾通栓（QLBETS）由黑龍江省濟仁藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字：Z20020130；丙酸睪酮注射液由天津金耀氨基酸有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字：H12020531；兔抗鼠雄激素受體（AR）多克隆抗體、即用型鏈霉素親和過氧化物酶復(fù)合物（SABC）免疫組化染色試劑盒、DAB顯色劑、0.1 mol／L磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.3）、0.01mol／L枸櫞酸鹽緩沖液（pH 7.3）由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組、造模及給藥方法：昆明種小鼠60只，隨機分成6組，即對照組、模型組、CDXT低（0.225 g／kg）、中（0.45 g／kg）、高劑量組（0.9 g／kg）、陽性對照組（QLBETS，0.67 g／kg）。對照組于消毒部位皮下注射滅菌橄欖油（5 mL／kg），其余小鼠則皮下注射丙酸睪酮溶液（5mg／kg），連續(xù)皮下注射21 d，同時，對照組及模型組直腸給予等容量蒸餾水，各組按上述劑量分2次給藥，即每天上午9點及下午1點直腸給藥各1次，連續(xù)給藥21 d。

1.3.2 觀察指標(biāo)：末次給藥后24 h，稱小鼠體質(zhì)量，脫頸椎處死小鼠。取前列腺組織，電子天平稱取前列腺濕重，計算其相應(yīng)的前列腺指數(shù)：前腺指數(shù)＝前列腺重／體質(zhì)量（mg／g）。

1.3.3 前列腺組織病理形態(tài)學(xué)檢查：取相同部位的前列腺組織迅速放入10%中性福爾馬林中固定，石蠟包埋切片，HE染色。光鏡下觀察前列腺組織病理改變。

前列腺病理改變分級標(biāo)準(zhǔn)：①前列腺上皮組織增生、腺體增生：未出現(xiàn)該病變?yōu)殛幮?，出現(xiàn)該病變占組織塊30%以下為輕度，占組織塊30～50%為中度，占組織塊50%以上為重度。②間質(zhì)纖維組織增生：在間質(zhì)內(nèi)纖維組織數(shù)量增多，呈漩渦狀或不規(guī)則排列，無該病變?yōu)殛幮裕霈F(xiàn)該病變占組織塊內(nèi)腺體30%以下為輕度，占組織塊內(nèi)腺體30～50%為中度，占組織塊內(nèi)腺體50%以上為重度。

1.3.4 透視電鏡檢查：取前列腺組織約1 mm×1mm×1mm的組織塊，迅速用25%戊二醛固定，在透射電鏡下觀察超微結(jié)構(gòu)病理變化。

1.3.5 雄激素受體（AR）檢測：前列腺組織常規(guī)固定，制成厚度為4μm的石蠟切片。用免疫組化染色（SABC法）檢測前列腺組織中AR的表達，顯微鏡觀察，胞核上出現(xiàn)棕黃色顆粒的即為陽性細(xì)胞，用PBS代替一抗做陰性對照。結(jié)果判斷：AR陽性表達為組織細(xì)胞核呈棕色顆粒，顯色結(jié)果采用BI-2000圖像分析系統(tǒng)分析，每張切片取10個×400視野，分別計算100個間質(zhì)和上皮細(xì)胞的陽性細(xì)胞數(shù)，取平均值，計算陽性表達顆粒所占百分率。根據(jù)著色強度、范圍和分布分為4級［24］：細(xì)胞內(nèi)外無淡黃及棕黃色顆粒，或陽性顆粒在5%以下為“－”；細(xì)胞內(nèi)淡黃及棕黃色顆粒占整個切片的5%～30%為“＋”；細(xì)胞內(nèi)淡黃及棕黃色顆粒占整個切片的30%～70%為“＋＋”；細(xì)胞內(nèi)淡黃及棕黃色顆粒占整個切片的70%以上為“＋＋＋”。

2 結(jié)果

2.1 CDTX對小鼠前列腺指數(shù)的影響 與對照組相比，模型組大鼠前列腺指數(shù)增大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組相比，CDTX高、中劑量組、QLBETS組均可明顯降低前列腺指數(shù)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，見表1）。

表1 CDTX對小鼠前列腺指數(shù)的影響Tab.1 The effect of CDTX on the coefficient of prostate in mice

2.2 CDTX對小鼠前列腺組織病理學(xué)的影響 光鏡下觀察正常組小鼠前列腺組織腺體結(jié)構(gòu)異常，腺上皮呈單層柱狀，腺腔內(nèi)可見分泌物，腺腔未見擴張；模型組小鼠前列腺組織腺上皮增生、腺體增生明顯，腺上皮呈復(fù)層或假復(fù)層柱狀，間質(zhì)增生明顯，腺腔內(nèi)可見大量分泌物，部分腺腔擴張；CDTX高、中給藥組小鼠前列腺組織腺上皮、腺體增生程度明顯下降，間質(zhì)增生程度降低，腺腔內(nèi)分泌物較模型組減少，少數(shù)腺腔擴張（見圖 1）。

圖1 光鏡下各組小鼠前列腺組織病理學(xué)HE染色結(jié)果（×100）Fig.1 HE results of prostate tissues ofmouses in each group（×100）

2.3 各組小鼠前列腺病理改變相關(guān)檢測指標(biāo)統(tǒng)計結(jié)果模型組小鼠前列腺上皮及腺體增生明顯，腺腔明顯擴張，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。CDXT高、中劑量組、QLBETS組小鼠前列腺上皮增生、腺體增生、間質(zhì)增生均有所減輕，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01，見表2）。

表2 CDXT對小鼠前列腺增生病理改變的影響［n（%）］Tab.2 The effect of CDTX on the pathological changes［n（%）］

2.4 透視電鏡檢查 正常組前列腺上皮細(xì)胞可見大量的線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴張成池，高爾基體豐富發(fā)達。模型組前列腺上皮細(xì)胞可見異常豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)重度擴張，線粒體數(shù)目減少，可見部分線粒體擴張或呈空泡樣改變，高爾基體數(shù)目亦減少。CDTX高劑量組前列腺上皮細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴張，線粒體數(shù)目基本正常，僅見少量線粒體輕度擴張，少見空泡性改變，高爾基體數(shù)目基本正常（見圖2）。

圖2 電鏡下各組小鼠前列腺組織HE染色結(jié)果（×2000）Fig.2 HE results of prostate tissues ofmouse in each group（×2000）

2.5 CDTX對小鼠前列腺組織中AR表達的影響 AR陽性信號呈棕黃色顆粒位于細(xì)胞核上。對照組小鼠前列腺組織有少量AR陽性細(xì)胞，分布較分散，且顏色淺淡；模型組小鼠前列腺組織AR陽性細(xì)胞呈強陽性表達，染色較深，分布較多；治療組小鼠前列腺組織AR陽性細(xì)胞數(shù)較模型組減少，染色減輕，分布較模型組有所減少（見圖3、表3）。

圖3 各組小鼠前列腺組織AR表達（HE，×100）Fig.3 Prostate tissues ofmouse in themiddle CDXT dosage group（HE，×100）

表3 CDXT對小鼠前列腺增生前列腺組織中AR表達的影響Tab.3 Effect of CDTX on expression of AR of prostate tissue of benign prostatic hyperplasia in mice

3 討論

前列腺增生是老年男性的常見病、多發(fā)病。關(guān)于BPH的發(fā)病機制，目前主要有以下幾種學(xué)說：激素-內(nèi)分泌學(xué)說、生長因子學(xué)說、上皮-間質(zhì)細(xì)胞相互作用學(xué)說、細(xì)胞凋亡與基因調(diào)控學(xué)說等。然而作為一個多病因疾病，以上任何一種學(xué)說都不可能獨立解釋BPH的發(fā)病機制。大量研究證實，BPH的發(fā)生與雄激素及其受體有很大的關(guān)系［8-10］。

前列腺是一種雄激素依賴性器官，雄激素對前列腺的發(fā)生、發(fā)展、疾病有很大的影響。雄激素可通過刺激前列腺上皮和前列腺基質(zhì)細(xì)胞增殖，從而促進前列腺增生。大量實驗研究表明動物通過外源性給予雄激素后，可造成前列腺增生動物模型，其病理改變與臨床病理改變相似，實驗結(jié)果對于臨床用藥具有指導(dǎo)意義［11-12］。本實驗參照唐望海等［13］，給小鼠皮下注射丙酸睪酮，實驗結(jié)果顯示CDXT可降低模型組小鼠前列腺指數(shù)，光鏡下可見模型組小鼠前列腺腺體、腺上皮增生及間質(zhì)纖維組織增生明顯；CDXT高、中劑量組小鼠則可見其腺體、腺上皮增生及間質(zhì)纖維組織增生程度明顯下降；透射電鏡下可見模型組小鼠前列腺上皮細(xì)胞線粒體空泡變，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)水腫擴張，與正常組間存在明顯差異；而高劑量組大鼠可見前列腺上皮細(xì)胞細(xì)胞器形態(tài)基本恢復(fù)正常。說明CDTX可改善BPH的病理組織結(jié)構(gòu)，對小鼠前列腺細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)也有明顯的改善，對BPH有一定的防治作用。

雄激素是前列腺增生癥不可缺少的條件，而雄激素生物學(xué)效應(yīng)則是由細(xì)胞內(nèi)受體（核受體）介導(dǎo)的，AR屬于甾體激素核受體，是抑制雄激素依賴性轉(zhuǎn)錄因子，由睪丸間質(zhì)細(xì)胞合成和分泌的睪酮（T）在5α-還原酶的作用下轉(zhuǎn)化為雙氫睪酮（DHT），后者與AR結(jié)合，調(diào)節(jié)基因促進細(xì)胞增殖和分化，從而引起前列腺增生。因此，雄激素發(fā)揮作用，與AR的表達有關(guān)［14-15］。實驗結(jié)果顯示模型組小鼠前列腺組織中AR表達明顯增加（P＜0.01），治療組小鼠前列腺組織中AR表達下降，表明在BPH發(fā)生過程中，AR表達增加可能促使前列腺增生；CDXT可降低BPH小鼠前列腺組織中AR的表達，從而減少雄激素與AR的結(jié)合，抑制前列腺增生。因此，降低前列腺組織中AR的表達可能是CDTX治療BPH的一個作用機制。

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（編校：吳茜）

Effect of complex of daxueteng on benign prostatic hyperplasia m ice induced by testosterone propionate

NIYang1，CUIYu-gui2

（1.Department of Pharmacy，Zhejiang Province Traditional Chinese Medical Hospital，Hangzhou 310006，China；2.Division of Medical Sciences，Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China）

ObjectiveTo study the preventive and therapeutical effect of complex of daxueteng（CDXT）on benign prostatic hyperplasia，in ordev to investigate themechanism of action of CDXT.Methods60 Kunmingmiceswere randomly divided into 6 groups，control group，model group，CDXT low（0.225 g／kg），（0.45 g／kg），high dose group（0.9 g／kg）and positive control group（QLBETS，0.67 g／kg）.Benign prostatic hyperplasia animal models were constructed by hypodermic injecting testosterone propionate，and treated with CDXT.The preventive and therapeutical effect of CDXT and the changes of prostate tissueswere observed.And then，we detected the expression of AR in prostatic tissue by immuno-histochemistry.ResultsCDXT decreased the coefficient of prostate inmice with benign prostatic hyperplasia（BPH）induced by testosterone propionate，and inhibited tissue hyperplasia of prostatic glandular epithelium，corpus glandulae hyperplasia and interstitial fiber tissue hyperplasia in model mice，improved prostate cell ultranstructure and lowed the expression of androgen receptor（AR）in prostatitic tissue ofmodelmice.ConclusionCDXT has good effect of prevention and cure to BPH.It can inhibit tissue hyperplasia of prostatic glandular epithelium and corpus glandulae hyperplasia，and improve prostate cell ultranstructure in prostatic mice.Itsmechanism may be related to the decreased expression of AR in prostatic tissue.

complex of daxueteng；benign prostatic hyperplasia；androgen receptor

R246.3

A

1005－1678（2014）05－0012－04

前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH）是臨床的常見病，多發(fā)于老年男性患者，我國60～69歲年齡段老人中重度前列腺增生的患病率約為66%，70歲以上的患病率則高達70%［1］，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。臨床表現(xiàn)為尿頻、排尿困難等下尿道癥狀，如不及時治療，嚴(yán)重者可導(dǎo)致尿潴留、腎功能損害。目前其病因及發(fā)病機制不清楚［2-3］，有研究表明，BPH的發(fā)生與雄激素及其受體相關(guān)，雄激素與其受體結(jié)合后，可促進前列腺細(xì)胞的增殖和分化［4］。

2011年國家自然科學(xué)基金（81170559）

倪陽，女，藥師，碩士，研究方向：臨床藥學(xué)，E-mail：penny7999＠163.com。