游瓊 吳鏗 黃海麗 閆海 莫海亮 葉少?gòu)?qiáng) 李上海

化橘紅有效成分柚皮苷對(duì)高糖誘導(dǎo)CMECs凋亡的抑制作用

游瓊 吳鏗 黃海麗 閆海 莫海亮 葉少?gòu)?qiáng) 李上海

目的 觀(guān)察化橘紅有效成分柚皮苷（Naringin）對(duì)高糖誘導(dǎo)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞（CMECs）凋亡的影響，探討Naringin對(duì)CMECs損傷的保護(hù)作用及可能的機(jī)制。方法 CMECs系分為正常糖組、高糖組、高糖+Naringin（50、100、200 μmol/L）處理組。Western印跡法檢測(cè)CMECs p38絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）（p38）、凋亡相關(guān)蛋白Caspase 9的表達(dá)及其活性；熒光探針JC-1觀(guān)察線(xiàn)粒體膜電位。結(jié)果 ①高糖刺激CMECs p38 MAPK信號(hào)通路的激活，p38蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，正常糖對(duì)照組僅有少量p38蛋白表達(dá)；高糖+Naringin（50、100、200 μg/ml）組 p38 蛋白表達(dá)量較高糖組明顯下降（P＜0.05）。②高糖培養(yǎng)誘導(dǎo) CMECs 48 h后可見(jiàn)Caspase 9的表達(dá)及其活性明顯增加，與正常糖組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），相應(yīng)CMECs線(xiàn)粒體膜電位降低；naringin（50、100、200 μmol/L）預(yù)處理 CMECs，明顯抑制高糖誘導(dǎo)的 CMECs Caspase 9 表達(dá)及其活性，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），抑制率分別是50%、64%、68%和54%、65%、68%；CMECs線(xiàn)粒體膜電位也不同程度降低。結(jié)論 化橘紅有效成分Naringin（50、100、200 μmol/L）能夠減少高糖誘導(dǎo)的CMECs凋亡，可能與其抑制p38 MAPK活化相關(guān)，并呈一定濃度依賴(lài)性。

心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞； 凋亡； p38絲裂原活化蛋白激酶； 柚皮苷； 高糖

糖尿病心肌?。╠iabetic cardiomyopathy，DC）是糖尿病最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，是導(dǎo)致慢性充血性心功能衰竭及糖尿病患者致殘和死亡的重要原因[1-3]。目前DC的早期防治已引起了各國(guó)學(xué)者的高度重視，并進(jìn)行了大量的研究，但DC確切的發(fā)病機(jī)制至今仍不清楚，臨床仍缺乏早期預(yù)測(cè)指標(biāo)和有效防治的藥物[4-6]。因此，如何防治DC已成為當(dāng)前醫(yī)學(xué)上的攻關(guān)重點(diǎn)。我們的前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，柚皮苷主要通過(guò)抑制心肌的炎癥損傷對(duì)DC起著防治作用[7-9]?？梢灶A(yù)見(jiàn)，以抑制炎癥為切入點(diǎn)，以抑制p38絲裂原激活蛋白激酶（mitogen-avtivated protein hinase，MAPK）炎癥通路對(duì)抗心肌微血管內(nèi)皮 細(xì) 胞 （cardiac microvascular endothelial cells，CMECs）凋亡及線(xiàn)粒體損傷為突破口，探討中藥化橘紅有效成分單體naringin如何減輕DC CMECs炎癥損傷，提高CMECs對(duì)高血糖的耐受性，對(duì)控制DC的發(fā)生發(fā)展具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞系（CMECs）（美國(guó)ATCC公司），新生小牛血清和DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）；柚皮苷（純度：HPLC法98%，廣東醫(yī)學(xué)院藥物開(kāi)發(fā)中心提供，從化橘紅中提取純化）；兔抗人p38抗體（美國(guó)Sigma公司）；Caspase 9單克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司）；Caspase 9活性檢測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）；線(xiàn)粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（JC-1）（碧云天生物技術(shù)有限公司）；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（南京凱基生物科技有限公司）；FragELTMDNA Fragmentation Detection Kit、BCA蛋白定量試劑盒、HRP結(jié)合的二抗、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（上海吉泰生物技術(shù)有限公司）。TS100倒置顯微鏡（日本Nikon），Leica熒光顯微鏡（德國(guó)），Beckman高速離心機(jī)（美國(guó)），Biorad電泳儀、Biorad半干轉(zhuǎn)膜儀、AlphaImager HP熒光/可見(jiàn)光凝膠成像分析系統(tǒng)（美國(guó)），TECAN GENios Pro多功能酶標(biāo)儀（瑞士）。

1.2 方法 CMECs培養(yǎng)及分組：取CMECs系，調(diào)整細(xì)胞密度至每毫升1×104個(gè)，接種于96孔板，每孔接種細(xì)胞懸液200μl，分為正常糖（葡萄糖濃度：11 mmol/L）組，高糖（葡萄糖濃度：33 mmol/L）組及高糖+柚皮苷高、中、低劑量（50、100、200 μg/ml）組，培養(yǎng)48 h后進(jìn)行以下檢測(cè)。

1.2.1 線(xiàn)粒體膜電位檢測(cè) 線(xiàn)粒體膜電位檢測(cè)使用碧云天生物技術(shù)研究所線(xiàn)粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（JC-1）。吸除培養(yǎng)液，根據(jù)實(shí)驗(yàn)具體情況，如有必要可以用PBS或其他適當(dāng)溶液洗滌細(xì)胞1次，加入1 ml細(xì)胞培養(yǎng)液。細(xì)胞培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅。加入1 ml JC-1染色工作液，充分混勻，細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20 mim。在孵育期間，按照1 ml JC-1染色緩沖液（5×）加入4 ml蒸餾水的比例，配制適量的JC-1染色緩沖液（1×），并放置于冰浴。37℃孵育結(jié)束后，吸除上清，用JC-1染色緩沖液（1×）洗滌2次，加入2 ml細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅。熒光顯微鏡下觀(guān)察。

1.2.2 Western blotting 取50 μg蛋白樣品與上樣緩沖液變性后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)移后的PVDF膜置于脫脂奶粉的洗滌緩沖液，室溫下在搖床輕搖封閉2 h，洗3次后加入一抗（兔抗人p38抗體、Caspase 9單克隆抗體），4℃過(guò)夜。加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，將膜置于ECL化學(xué)發(fā)光反應(yīng)液中室溫孵育3 min，去除過(guò)量的溶液，將膜夾在兩塑料薄膜之間，以X線(xiàn)膠片曝光，膠片用AlphaImager HP熒光/可見(jiàn)光凝膠成像分析儀處理，并用分析軟件將圖片上每個(gè)特異條帶灰度值數(shù)字化。

1.2.3 Caspase 9活性檢測(cè) 使用碧云天生物技術(shù)研究所Caspase 9活性檢測(cè)試劑盒。吸取細(xì)胞培養(yǎng)液，備用。胰酶消化細(xì)胞，并收集至備用的細(xì)胞培養(yǎng)液中。600 g，4℃離心5 min，收集細(xì)胞，PBS洗2次，吸干上清后加入裂解液重懸沉淀。冰上裂解15min，4℃，16 000 g離心15 min，將上清轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的離心管中，立即進(jìn)行Caspase 9酶活性檢測(cè)。在上清中加入預(yù)冷的Ac-LEHD-pNA（2 mM）后混勻，37℃孵育2 h，發(fā)現(xiàn)顏色變化比較明顯時(shí)檢測(cè)A450。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行換算。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用±s表示，用One-way ANOVA檢驗(yàn)，組間兩兩比較方差齊時(shí)采用SNK法，方差不齊時(shí)采用Dunnett’s T3法，顯著性標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 柚皮苷對(duì)高糖誘導(dǎo)的心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響 由圖1可見(jiàn)，相對(duì)于對(duì)照組，高糖培養(yǎng)CMECs，可明顯誘導(dǎo)CMECs DNA片段化的產(chǎn)生，上調(diào)CMECs的Caspase 9表達(dá)及其活性，50、100、200 μmol/L柚皮苷預(yù)處理CMECs，可明顯抑制高糖誘導(dǎo)的CMECs Caspase 9表達(dá)及其活性，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。抑制率分別是50%、64%、68%和54%、65%、68%。

圖1 柚皮苷對(duì)高糖誘導(dǎo)CMECs Caspase 9表達(dá)及其活性的影響

2．2 柚皮苷對(duì)線(xiàn)粒體膜電位的影響 如圖2所示，各組綠色熒光無(wú)明顯改變，所以只分析與高的線(xiàn)粒體膜電位（△Ψm）相應(yīng)的紅色熒光的變化。正常組心肌細(xì)胞△Ψm普遍較低，以綠色熒光（低膜電位）為主。隨著高糖誘導(dǎo)CMECs凋亡明顯，綠色熒光逐漸減弱，而紅色熒光（高膜電位）逐漸加強(qiáng)，說(shuō)明△Ψm 逐漸增高。加柚皮苷（50、100、200 μmol/L）預(yù)處理后，與高糖組△Ψm比較，抑制率分別為48%、55%和72%，說(shuō)明柚皮苷對(duì)高糖誘導(dǎo)線(xiàn)粒體膜電位損傷有保護(hù)作用。

2.3 柚皮苷對(duì)MAPK/P38信號(hào)通路的調(diào)控 由圖3可見(jiàn)，相對(duì)于對(duì)照組，高糖培養(yǎng)CMECs，MAPK/P38 的表達(dá)明顯增加；50、100、200 μmol/L 柚皮苷預(yù)處理CMECs，可以抑制高糖誘導(dǎo)MAPK/P38的表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。抑制率分別是40%、56%和62%。

圖3 柚皮苷對(duì)高糖誘導(dǎo)CMECs MAPK/P38表達(dá)的影響

3 討論

心臟是糖尿病累及的主要器官之一。DC的發(fā)病機(jī)制涉及微血管病變、心肌纖維化（fibrosis）、間質(zhì)炎癥、氧化應(yīng)激損傷及鈣內(nèi)穩(wěn)態(tài)異常等各個(gè)方面[5,10，11]。隨著研究的不斷深入，CMECs損傷及其致病機(jī)制逐漸被人們所認(rèn)識(shí)，并成為研究熱點(diǎn)。CMECs是一類(lèi)覆蓋于心肌微血管腔內(nèi)表面，具有不同于心臟血管內(nèi)皮細(xì)胞的多種功能特異性細(xì)胞，在炎癥反應(yīng)中扮演重要角色，是DC的首發(fā)部位，也是DC發(fā)生發(fā)展的始動(dòng)環(huán)節(jié)，故CMECs成為防治炎癥損傷的靶點(diǎn)[3]。

目前認(rèn)為，MAPK家族中的重要成員之一，p38MAPK在DC的發(fā)生中被激活[12,13]。在哺乳類(lèi)的多種實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，p38MAPK通路能被環(huán)境應(yīng)激及炎癥細(xì)胞因子所激活，并參與細(xì)胞死亡[14-19]。有報(bào)道指出，p38MAPK通路是糖尿病血管病變的共同炎癥通路[20]。在STZ誘導(dǎo)的DCM模型，磷酸化（代表被激活）p38 MAPK表達(dá)明顯增多[12,13]。具有抗炎及抗氧化作用的大麻二酚（Cannabidiol）在抑制p38 MAPK通路的同時(shí)，也能明顯抑制炎癥因子（如TNF-α、iNOS、NFκ-β） 及細(xì)胞凋亡[13]，提示 p38 MAPK通路與DC炎癥及細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，通過(guò)p38 MAPK通路引起的炎癥可能在DC的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用[21]。本實(shí)驗(yàn)中我們檢測(cè)到高糖刺激CMECs p38 MAPK信號(hào)通路的激活，p38蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，正常糖對(duì)照組僅有少量p38活化；同時(shí)我們檢測(cè)證實(shí)，高糖培養(yǎng)誘導(dǎo)CMECs細(xì)胞Caspase 9表達(dá)及其活性明顯增加，相應(yīng)的CMECs線(xiàn)粒體膜電位降低。

提及化橘紅，人們首先想到的是“南方人參”和“一片值千金”之稱(chēng)謂。清《本草綱目拾遺》載：“橘紅果皮辛、苦，性溫，理氣燥濕、溫肺化痰、治肺寒咳多痰、胸膈脹悶、嘔吐噯氣等癥?！彪S著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，學(xué)者們本著“古為今用”、“承前啟后”的宗旨，應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)和方法對(duì)化橘紅的有效成分單體柚皮苷（Naringin）進(jìn)行了提取及分子結(jié)構(gòu)分析。Naringin又稱(chēng)柚甙、柑橘甙、異橙皮甙，是一種雙氫黃酮類(lèi)化合物。除了化橘紅外，Naringin也是中藥骨碎補(bǔ)、枳實(shí)、枳殼的主要有效成分。近年，在離體細(xì)胞模型和在體實(shí)驗(yàn)均證實(shí)，柚皮苷具有多種生物學(xué)活性及藥理作用，特別是具有明顯的糖脂代謝作用，能有效地防治心血管疾病[7-9,22]。我們的研究結(jié)果表明，在高糖環(huán)境下，48 h可見(jiàn)明顯細(xì)胞凋亡，Naringin（50、100、200 μmol/L）干預(yù)后，可以明顯減輕高糖誘導(dǎo)的CMECs凋亡，明顯下調(diào)MAPK/P38的表達(dá)，并呈一定的濃度依賴(lài)性。

綜上所述，本研究證實(shí)化橘紅的有效成分單體Naringin可通過(guò)部分抑制p38 MAPK活化，減少高糖誘導(dǎo)的CMECs凋亡，起到保護(hù)心臟作用。這為揭示DC的發(fā)病機(jī)制提供新的研究方向，為其防治拓展新的思路，為應(yīng)用Naringin治療DC提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并奠定理論基礎(chǔ)。

圖2 柚皮苷對(duì)高糖誘導(dǎo)CMECs線(xiàn)粒體膜電位的影響

4 參與文獻(xiàn)

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Inhibition of Pummelo Peel active ingredient Naringin on high glucose-induced CMECs apoptosis

YOU Qiong，WU Keng，HUANG Hai-li，et al.Division of Cardiology，Department of Internal Medicine，Clinical Scientific Research Center，the Affiliated Hospital of Guangdong Medical College，Zhanjiang 524001，China

WU Keng，E-mail：zjwukeng@hotmail.com

Objective To explore the therapeutic effects of Pummelo Peel active ingredient Naringin on high glucose-induced cardiac microvascular endothelial cells（CMECs） injury and understand its mechanism．Methods The CMECs system were divided into normal glucose group（NG），high glucose group（HG）and HG with Naringin at high，medium and low dose（50，100，200 μmol/L） group.The expression of p38MAPK and the expression and activity of Caspase 9 were determined by Western blot mitochondrial membrane potential was detected by Fluorescence probe JC-1.Results ⑴CMECs with high glucose could activate the p38 MAPK signaling pathway.The expression of p38MAPK was significantly elevated．Little expression of p38MAPK was observed in NG．As compared to HG，the expression of p38MAPK was significantly lowered in Naringin groups．⑵The expression and activity of Caspase 9 increased in HG with upregulated mitochondrial membrane potential after 48 h．It was significantly higher than those in NG.Naringin（50，100，200 μmol/L）could reduce the CMECs Caspase 9 in－duced by high glucose 50%，64%，68%and 54%，65%，68%respectively，and downregulated mitochondrial membrane potential．Conclusion Naringin can inhibit high glucose-induced CMECs apoptosis．And this effect may be involved in its inhibition of activation of p38MAPk，and a certain concentration dependence.

Cardiac microvascular endothelial cells； Apoptosis； p38 mitogen-activated protein kinase； Naringin； High glucose

廣東省重大科技專(zhuān)項(xiàng)（項(xiàng)目編號(hào)：2012A080202020）；

廣東省中醫(yī)藥局資助項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：20121112）；

524001 湛江市，廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院臨床科研中心

吳鏗，E-mail:zjwukeng@hotmail.com

10．3969/j．issn．1672－5301．2014．07．015

R542.2+2

A

1672-5301（2014）07-0629－04

2014-03-06）

湛江市財(cái)政資金科技專(zhuān)項(xiàng)競(jìng)爭(zhēng)性分配項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：湛科［2011］79號(hào)）；

廣東醫(yī)學(xué)院科研基金（項(xiàng)目編號(hào)：M2011031）