姚慶收 姜吉?jiǎng)?武玉永 梁乘榜

白藜蘆醇是一種天然的抗氧化劑，具有重要的藥用價(jià)值［1，2］。近年來(lái)，Ri質(zhì)粒及其發(fā)根培養(yǎng)系統(tǒng)因其在次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)方面的優(yōu)越性而被廣泛重視［3，4］，并成為藥用植物可持續(xù)發(fā)展的有效途徑之一?；ㄉ泻休^高的白藜蘆醇，花生（包括根、莖、果仁）將會(huì)成為生產(chǎn)白藜蘆醇及與其相關(guān)醫(yī)藥、保健品的重要植物資源［5］，因此利用花生毛狀根進(jìn)行白藜蘆醇的生產(chǎn)具有現(xiàn)實(shí)意義。

本試驗(yàn)利用發(fā)根農(nóng)桿菌R1601介導(dǎo)，對(duì)花生葉片進(jìn)行誘導(dǎo)，獲得毛狀根后，經(jīng)PCR鑒定，選取轉(zhuǎn)染成功的生長(zhǎng)快的毛狀根株系，利用不同培養(yǎng)基培養(yǎng)，對(duì)經(jīng)培養(yǎng)后毛狀根的生物量和毛狀根中白藜蘆醇含量進(jìn)行測(cè)定，探究不同培養(yǎng)基對(duì)毛狀根的生物量和白藜蘆醇含量的影響，旨在為進(jìn)一步篩選并建立適宜的花生毛狀根培養(yǎng)體系，用于生產(chǎn)白藜蘆醇奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 發(fā)根農(nóng)桿菌R1601，魯花11號(hào)，毛狀根株系。

1.1.2 主要試劑 主要試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，分子生物學(xué)試劑購(gòu)自上海生工生物工程有限公司，白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自上海融禾醫(yī)藥科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 MS、B5和N6培養(yǎng)基的組分參照李志勇等［6］，配制的培養(yǎng)基pH為5.8。1/2MS培養(yǎng)基是在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)成分、蔗糖用量均減半，其他同MS培養(yǎng)基。配制加入抗生素的MS培養(yǎng)基，在原有MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，在培養(yǎng)基滅菌冷卻但未凝固時(shí)加入500mg/L的羧芐西林鈉，其他條件同MS培養(yǎng)基。其中1/2MS培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基，其它為固體培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 花生毛狀根的誘導(dǎo)及鑒定 主要試驗(yàn)過(guò)程參照文獻(xiàn)［7］，取花生魯花11號(hào)葉片，流水沖洗30min，用4％的NaClO浸泡5-10min后，無(wú)菌水沖洗3-4次，每次5min，將葉片切成0.5cm左右，并輕輕劃上傷口，置于發(fā)根農(nóng)桿菌R1601培養(yǎng)液（A600=0.8）中5-10min，取出外植體，置于MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)2-3d，轉(zhuǎn)移到含500mg/L羧芐西林鈉的MS培養(yǎng)基上2-3d（根據(jù)發(fā)根農(nóng)桿菌生長(zhǎng)情況，可以多次進(jìn)行該步驟，直至發(fā)根農(nóng)桿菌被去除），置于無(wú)激素MS培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)毛狀根。另做一份為對(duì)照，除不與發(fā)根農(nóng)桿菌接觸外，其余操作均相同。誘導(dǎo)出毛狀根后，剪取毛狀根，移到含500mg/L羧芐青霉素的MS培養(yǎng)基上除菌培養(yǎng)，每3-5d轉(zhuǎn)接1次，直至去除發(fā)根農(nóng)桿菌R1601后，繼代培養(yǎng)用于后續(xù)試驗(yàn)。利用CTAB法提取花生毛狀根和葉片DNA，根據(jù)Ri質(zhì)粒序列，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR鑒定。

1.2.2 毛狀根的繼代培養(yǎng) 選取一株經(jīng)PCR鑒定的優(yōu)良的花生毛狀根繼代培養(yǎng)，擴(kuò)繁，并作為培養(yǎng)株系用于生物量和白藜蘆醇含量的測(cè)定。每瓶加入80mL MS培養(yǎng)基（培養(yǎng)瓶為ZP16-340廣口瓶，上海稼豐園藝用品有限公司生產(chǎn)）。具體培養(yǎng)條件為MS培養(yǎng)基、B5培養(yǎng)基、N6培養(yǎng)基和MS+500mg/mL培養(yǎng)基為固體，培養(yǎng)條件為26℃，光照條件為2000 lx，12h/d光照，培養(yǎng)，1/2MS培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為26℃，160r/min，暗黑條件。

1.2.3 毛狀根生物量測(cè)定 將培養(yǎng)4周的毛狀根進(jìn)行生物量（生物量=收獲量-接種量）的測(cè)定，將毛狀根團(tuán)塊中所含的培養(yǎng)基去掉，用水洗凈晾干，稱鮮重，對(duì)不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的毛狀根株系的生物量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.4 毛狀根中白藜蘆醇含量的測(cè)定

1.2.4.1 白藜蘆醇的提取 對(duì)不同培養(yǎng)基上收獲的毛狀根，于60℃烘干，將同一培養(yǎng)基收獲的毛狀根混合，隨機(jī)分為3組，按照文獻(xiàn)［8］中超聲波提取法對(duì)不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的毛狀根進(jìn)行白藜蘆醇的提取，作為測(cè)試樣品備用。

1.2.4.2 對(duì)照品溶液和測(cè)試樣品溶液的制備 精密稱取白藜蘆醇對(duì)照品5mg，于25mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得到0.20mg/mL的對(duì)照品溶液，備用。

1.2.4.3 樣品中白藜蘆醇含量的測(cè)定 色譜條件和標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制按照文獻(xiàn)［8］進(jìn)行，繪制得到回歸方程。然后測(cè)定待測(cè)溶液的峰面積并將此值帶入回歸方程求得待測(cè)溶液中白藜蘆醇的含量。

1.2.5 不同培養(yǎng)基毛狀根中白藜蘆醇總量 設(shè)定同一培養(yǎng)基毛狀根中白藜蘆醇總量=毛狀根生物量（干重總量）×毛狀根中白藜蘆醇含量，計(jì)算不同培養(yǎng)基中毛狀根中白藜蘆醇的總量（以每種培養(yǎng)基接種相同瓶數(shù)為基礎(chǔ)）。

2 結(jié)果

2.1 花生葉片毛狀根的誘導(dǎo)及PCR鑒定

用發(fā)根農(nóng)桿菌R1601侵染花生的葉片，1周左右感染發(fā)根農(nóng)桿菌的花生葉片在傷口部位出現(xiàn)白色突起，2周左右分化為白色細(xì)根（圖1），生長(zhǎng)速度快，生根密度大。

圖1 花生葉片誘導(dǎo)的毛狀根

通過(guò)設(shè)計(jì)rolB基因的特異引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如圖2中1、2、5、6泳道所示，能夠以葉片誘導(dǎo)的毛狀根的DNA為模板擴(kuò)增到預(yù)期的條帶（865bp），說(shuō)明所獲得的毛狀根為發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體，可以用于繼代培養(yǎng)。

圖2 毛狀根PCR檢測(cè)電泳圖

2.2 花生毛狀根繼代培養(yǎng)

固體培養(yǎng)基中，在相同時(shí)間內(nèi)，MS培養(yǎng)基中的花生毛狀根克隆系生長(zhǎng)快，生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，根呈乳白色，不發(fā)生褐化現(xiàn)象，較少出現(xiàn)表皮褐化（圖3），大約經(jīng)過(guò)4周左右即可長(zhǎng)滿培養(yǎng)基。加入500mg/mL的MS固體培養(yǎng)基中的花生毛狀根生長(zhǎng)慢，在3周后根尖開(kāi)始出現(xiàn)老化，表皮褐化，4周左右不能長(zhǎng)滿培養(yǎng)基，抗生素有效抑制雜菌，很少發(fā)生污染，但對(duì)毛狀根的生長(zhǎng)有抑制作用，形態(tài)上與MS培養(yǎng)基中的毛狀根也略有區(qū)別，主干根段變粗，顏色略黃（圖4）。B5和N6培養(yǎng)基中的花生毛狀根生長(zhǎng)勢(shì)弱，生長(zhǎng)慢，外部形態(tài)縮短變粗現(xiàn)象比加抗生素的MS培養(yǎng)基明顯，隨著生長(zhǎng)表皮褐化，4周左右也不能長(zhǎng)滿培養(yǎng)基（圖5）。

1/2MS培養(yǎng)基是液體培養(yǎng)基，生長(zhǎng)速度快，外部形態(tài)生長(zhǎng)正常，無(wú)縮短變粗現(xiàn)象，但表皮褐化較快，只有根尖保持乳白色，4周時(shí)已經(jīng)能夠長(zhǎng)滿培養(yǎng)液（圖 6）。

由于固體和液體培養(yǎng)基中，生長(zhǎng)最快的經(jīng)過(guò)4周左右即可長(zhǎng)滿培養(yǎng)基，故選取4周的毛狀根進(jìn)行生物量和白藜蘆醇的測(cè)定。

圖3 MS固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的毛狀根

圖4 MS+500mg/mL羧芐西林鈉固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的毛狀根

圖5 N6固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的毛狀根

圖6 1/2MS液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的毛狀根

2.3 不同培養(yǎng)基中毛狀根生物量測(cè)定

選取4周的毛狀根進(jìn)行生物量測(cè)定，不同培養(yǎng)基之間的生物量如表1所示。

表1 不同培養(yǎng)基毛狀根生物量測(cè)定及分析

對(duì)不同培養(yǎng)基之間的生物量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示，不同培養(yǎng)基之間生物量的變化明顯不同，4周內(nèi)，1/2MS培養(yǎng)基和MS培養(yǎng)基花生毛狀根的生物量積累明顯要快；MS+羧芐西林鈉（500mg/L）、B5和N6的培養(yǎng)基上花生毛狀根生物量的積累慢，產(chǎn)量遠(yuǎn)低于1/2MS培養(yǎng)基和MS培養(yǎng)基上的毛狀根，1/2MS培養(yǎng)基和MS培養(yǎng)基之間無(wú)差異，但與其他3種培養(yǎng)基差異極顯著，但MS+羧芐西林鈉（500mg/L）、B5和N6的培養(yǎng)基之間有差異顯著但無(wú)極顯著性差異。說(shuō)明不同培養(yǎng)基對(duì)毛狀根生物量的積累有明顯差異，其中1/2MS培養(yǎng)基和MS培養(yǎng)基有利于毛狀根生物量的積累。

2.4 不同培養(yǎng)基毛狀根中白藜蘆醇含量的測(cè)定

根據(jù)不同濃度梯度的白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品得到HPLC的線性回歸方程：y=7.8×107x+6390，R2=0.9931。由HPLC測(cè)定得知白藜蘆醇在tR=5.070附近出峰。根據(jù)回歸方程得出供試樣品濃度，計(jì)算各樣品白藜蘆醇含量及SAS8.1軟件統(tǒng)計(jì)分析如表2所示。

表2 不同培養(yǎng)基毛狀根白藜蘆醇含量測(cè)定分析

由表2可見(jiàn)，在不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的毛狀根中，B5培養(yǎng)基中培養(yǎng)的毛狀根中白藜蘆醇的含量最高；1/2MS 培養(yǎng)基中的毛狀根中白藜蘆醇的含量最低。MS+羧芐西林鈉（500mg/L）與MS培養(yǎng)基中毛狀根的白藜蘆醇含量差異顯著，但無(wú)極顯著差異；B5和N6培養(yǎng)基中毛狀根的白藜蘆醇含量無(wú)顯著差異。說(shuō)明B5和N6培養(yǎng)基適合于以獲得白藜蘆醇為目的的毛狀根培養(yǎng)。

2.5 不同培養(yǎng)基毛狀根中白藜蘆醇的總量

根據(jù)毛狀根中白藜蘆醇總量=毛狀根生物量（干重總量）×毛狀根中白藜蘆醇含量，計(jì)算出同一培養(yǎng)基中毛狀根中白藜蘆醇的總量，結(jié)果（表3）顯示，根據(jù)生物量或者白藜蘆醇含量這兩個(gè)因素中的任何一個(gè)因素的量高或量低，并不能就能確定最終收獲的白藜蘆醇的量多或量少，判定某種培養(yǎng)基是最適合的培養(yǎng)基，或者調(diào)整某種培養(yǎng)基，需要結(jié)合生物量和白藜蘆醇的含量共同判斷。

表3 不同培養(yǎng)基毛狀根白藜蘆醇總量

3 討論

由于毛狀根起源于單細(xì)胞，這些細(xì)胞在結(jié)構(gòu)、大小、遺傳和生理生化等特征上各不相同，其代謝狀態(tài)和合成次生物質(zhì)的能力也不同［9］。本試驗(yàn)選取了PCR技術(shù)鑒定為轉(zhuǎn)染成功并生長(zhǎng)旺盛的毛狀根單克隆系作為繼代培養(yǎng)的材料，以期為后續(xù)試驗(yàn)提供一個(gè)統(tǒng)一的基礎(chǔ)條件，盡量減少試驗(yàn)影響因素。

各種培養(yǎng)基由于所含組分及其比例不同，對(duì)毛狀根生長(zhǎng)和次生產(chǎn)物的形成有不同的影響［10-16］。本試驗(yàn)中選取的5種培養(yǎng)基的成分不盡相同，MS培養(yǎng)基是富集元素平衡培養(yǎng)基［17］，成分較多，營(yíng)養(yǎng)元素豐富；1/2MS培養(yǎng)基是在MS培養(yǎng)基基礎(chǔ)上不添加瓊脂粉外對(duì)各成分減半獲得，B5和N6培養(yǎng)基是高硝酸鉀含量培養(yǎng)基［17］。試驗(yàn)顯示1/2MS和MS培養(yǎng)基有利于生物量的積累，這可能與其營(yíng)養(yǎng)元素全面相關(guān)，毛狀根的生長(zhǎng)是細(xì)胞不斷分裂和生長(zhǎng)的結(jié)果，涉及的生化代謝過(guò)程特別復(fù)雜，培養(yǎng)基成分全面就有助于這些生化過(guò)程的進(jìn)行，有助于生物量的積累。而添加了抗生素后由于抗生素的作用，生物量降低，說(shuō)明羧芐西林鈉對(duì)毛狀根的生長(zhǎng)有抑制作用。而B(niǎo)5和N6培養(yǎng)基由于屬于高硝酸鉀含量培養(yǎng)基，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)種類較MS培養(yǎng)基少，顯示出相同時(shí)間內(nèi)生物量的積累要低，說(shuō)明不同培養(yǎng)基對(duì)毛狀根的生物量積累是有很大影響的，進(jìn)行培養(yǎng)基的選擇，是培養(yǎng)毛狀根獲得高生物量的前提。

培養(yǎng)基中銨態(tài)氮和硝態(tài)氮之間的比例也會(huì)影響毛狀根生長(zhǎng)和次生代謝產(chǎn)物的合成［11，18］。本試驗(yàn)中，B5和N6培養(yǎng)基最有利于白藜蘆醇量的積累，顯著優(yōu)于MS和1/2MS培養(yǎng)基。而這可能是由于B5和N6是屬于高硝酸鉀含量培養(yǎng)基，硝態(tài)氮比例高，在白藜蘆醇的合成過(guò)程中有助于其中的生化代謝途徑，從而提高了毛狀根中的白藜蘆醇含量。

本試驗(yàn)表明根據(jù)單一的生物量或者白藜蘆醇含量，并不能判定某種培養(yǎng)基是最適合的培養(yǎng)基，需要結(jié)合生物量和白藜蘆醇的含量共同判斷，因此生物量和白藜蘆醇含量這兩個(gè)因素為選擇或者改進(jìn)培養(yǎng)基提供了重要的依據(jù)，也為今后的試驗(yàn)研究提供了思路，今后應(yīng)向?qū)で竺珷罡L(zhǎng)速度與白藜蘆醇含量達(dá)到最佳結(jié)合的培養(yǎng)基種類探索，使之達(dá)到生產(chǎn)上的最大效益。

4 結(jié)論

探究了不同培養(yǎng)基對(duì)花生毛狀根株系生物量積累和白藜蘆醇含量的影響，表明1/2MS培養(yǎng)基和MS培養(yǎng)基有利于花生毛狀根株系生物量的積累，B5培養(yǎng)基和N6培養(yǎng)基有利于花生毛狀根株系中白藜蘆醇的積累。

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