趙仲麟 李燕 袁超

（1.河南農業(yè)大學理學院，鄭州 450002；2.鄭州輕工業(yè)學院食品與生物工程學院，鄭州 450002）

適配子是從組合核酸庫中篩選到的、與靶分子具有高度親和性的分子［1]。與抗體類似，適配子對目標分子具有高度親和性和特異性。然而適配子還有很多額外的優(yōu)點，如可以抵抗還原條件和熱變性等。典型的適配子一般少于40個核苷酸，同時還要易于化學合成。另外，適配子可以在一些生理條件下，可通過反義寡核苷酸雜交使其失活。因此，可以用于設計解毒劑。適配子在分子生物學和醫(yī)學已經被廣泛應用［2]。適配子通過SELEX技術，即指數富集配體系統(tǒng)進化技術，經反復的放大篩選得到的［3，4]。這個過程中，單鏈核酸庫與靶分子孵育，單鏈核酸包括DNA、RNA和修飾的核酸，庫由30-100個核苷酸的隨機序列組成，約含1014-1015變異體。與目標有結合活性的變異體將被回收，然后通過RT-PCR進行文庫富集擴增，然后利用富集的PCR產物，通過模板鏈除去或體外轉錄重建單鏈庫。該過程將重復幾輪至20輪不等，最終找到目標適配子。

SELEX程序最早于1990年建立［3，4]，適配子可與多種目標作用，包括可與大分子蛋白作用的小分子化合物。SELEX過程中使用高純度的目標分子，一種理論研究認為復合目標也可以用于尋找特異的適配子［5]。這種觀點已經通過實驗得到了確認［6，7]。如果與負選擇相結合進行識別，那些可與非目標結合的變異體可被除去，得到目標特異的適配子（圖1）。如果SELEX過程使用活細胞，則可對活細胞的變種進行檢驗，稱為Cell-SELEX 技術。本文對Cell-SELEX 技術的發(fā)展進行綜述。

圖1 Cell-SELEX

1 Cell-SELEX用于活病原微生物適配子篩選

適配子可以用于開發(fā)診斷試劑和藥物，而且活的病原微生物變種也可以作為Cell-SELEX技術的操作對象［7]。最早Cell-SELEX技術的應用例子是使用活病原微生物，非洲布氏錐蟲Trypanosoma brucei。T.brucei是單細胞原生動物寄生蟲，有兩個寄主，昆蟲和哺乳動物寄主。寄生蟲可以引起非洲昏睡病，一種人類慢性病和牲畜那加那病。該寄生蟲的一個特點是其表面具有被稱為可變表面糖蛋白（VSG）構成的保護殼，可逃脫宿主的免疫系統(tǒng)。Homann等［8]利用SELEX技術，將血液中活的布氏錐蟲作為目標，篩選到了幾個與寄生蟲具有高度親和力的RNA適配子。同時他們還發(fā)現得到的適配子能結合到VSG變種上。他們利用氟代嘧啶修飾的RNA庫，通過SELEX技術與VSG變異體VSG117作用，然后再與活布氏錐蟲穩(wěn)定表達的VSG變異體作用。經過若干輪SELEX后，純化得到一個不同的變異體VSG221，最后再與寄生蟲作用。篩選得到的適配子顯示出了與變異體高親和力。

Ulrich等［9]使用SELEX策略，以另一種活的寄生蟲熱帶南美洲錐蟲Trypanosoma cruzi為目標篩選適配子。T. cruzi可引起chagas巨食管癥，是一種人類的致命疾病?，F已知寄生蟲表面與宿主細胞基質分子進行相互作用，這恰巧與寄生蟲侵染相關。研究者想找到能與基質分子競爭，并可與寄生蟲結合的適配子。他們將T. cruzi與RNA庫孵育，然后通過添加過量的基質分子，如纖維連接蛋白、粘連蛋白、硫酸乙酰肝素、血管內皮抑制因子等，來特異的洗脫目的適配子。接下來他們使用短膜蟲期的寄生蟲，這個階段屬于非傳染階段，利用負篩選除去不需要的適配子。最終成功的得到了能與目標寄生蟲作用的適配子，最后通過體外侵染試驗證實這些適配子具有抑制活性。

2 癌細胞特異性適配子篩選

由于適配子可以識別多種特定的哺乳動物細胞，因此，可以將其作為診斷和基礎研究的分子探針。癌細胞是最廣泛的檢測目標，目前已發(fā)現多種適配子可以與癌細胞進行相互作用［10，11]。通過熒光標記，適配子可以作為癌癥檢測探針。Shangguan等［12]報道了一系列DNA適配子，可作為分子探針用于癌癥研究。他們使用人急性淋巴細胞白血病T淋巴細胞（CCRF-CEM）和人源Burkitt淋巴瘤B細胞系分別進行正負篩選。使用幾種癌細胞和經蛋白酶處理的CCRF-CEM細胞進行結合分析試驗，結果顯示每種適配子只識別一種特定的細胞表面分子。目前，已通過Cell-SELEX技術篩選到多種用于檢測癌細胞的適配子，其中包括淋巴細胞白血癥、粒細胞性白血病、肝癌、小細胞肺癌和非小細胞肺癌。這些適配子對靶細胞都具有較高的特異性［10]，這些結果均表明在不知道任何細胞表面蛋白種類和數量的情況下，也可通過該技術篩選適配子。

Cell-SELEX技術也用于體細胞和胚胎干細胞研究中［13]。Iwagawa等［14]利用RNA庫，以胚胎干細胞為目標進行篩選，得到的適配子能與胚胎干細胞高效結合。此外，鼠胚胎干細胞的分化過程也可以通過熒光標記的適配子進行監(jiān)控。干細胞研究對于再生醫(yī)學和發(fā)育生物學非常重要，因此開發(fā)新的、可用于干細胞研究的分子探針是及其必要的。

此外，Cell-SELEX技術也可以篩選一些能與病毒感染的細胞進行特異結合的DNA適配子。病毒感染后，宿主細胞表面被病毒蛋白所修飾，這些變化正好可作為病毒特異性目標，通過設計特異性分子探針來識別被病毒感染的細胞。Tang等［15]通過Cell-SELEX方法，以牛痘病毒感染的腺癌上皮細胞A549為目標，結合負篩選過程，成功得到特異性DNA適配子。分離得到的適配子可結合到幾種被病毒感染的細胞系，證實適配子能識別宿主細胞表面的病毒蛋白。

3 生物標記物篩選

Cell-SELEX可以用于靶細胞新生物標記物的識別。Blank等［16]報道利用Cell-SELEX技術進行大鼠YPEN-1內皮細胞和小鼠N9噬神經細胞的正負篩選。許多篩選到的適配子能結合到膠質母細胞瘤的病理性微管上，其中一個適配子只在實體瘤生長區(qū)域顯示出與脈管非常強的結合力，然后他們將該適配子的靶蛋白通過質量指紋圖譜和多肽測序進行分析，最終發(fā)現該蛋白是內皮分化的調控蛋白，在腫瘤的微血管中過表達。Berezovski等［17]發(fā)展出多種系統(tǒng)程序用于目標細胞的新生物標記物的識別，他們將該程序命名為 AptaBiD，包括3步：首先，通過Cell-SELEX技術構建適配子庫；接下來利用適配子庫的結合活性，親和分離候選的生物標記物。最后，通過肽質量指紋圖譜鑒定分離到的候選蛋白。Shoji等［18]構建了DNA適配子庫，利用Cell-SELEX技術作用于未成熟和成熟的樹突細胞，使用生物素標記的DNA庫，從目標細胞裂解液中分離候選的生物標記物，通過LC-MS分析經胰蛋白酶處理的候選蛋白，最終分別從未成熟的細胞中得到6個，從成熟的細胞中得到3個生物標記物，其中6個是以前未知的生物標記物。

4 基于SELEX技術的細胞攝取

Cell-SELEX 篩選得到的適配子不僅可以結合靶細胞，還可以進行胞內運輸。例如從活的T. brucei細胞篩選的一個適配子能夠通過胞吞作用迅速內化，通過小泡輸送轉運到溶酶體［7，10]。適配子這種內化特性可以使其進行胞內的藥物傳遞［19]，利用適配子介導的短RNA干擾已被試驗證實［20，21]。為產生能介導向目標特異細胞進行胞內藥物運輸的適配子，Wu等［22]開發(fā)出一套獨特的SELEX策略，正是基于胞內運輸。他們利用一個隨機庫與靶細胞孵育，通過嚴苛條件（0.2 mol/L glycine-HCl，pH4.0）洗脫，而后將這些洗脫的變異體合并，通過加入蛋白酶和清洗劑細胞裂解，進行選擇性回收。應用這種方法得到的DNA基元可以高效的運輸到人慢性淋巴細胞白血病B細胞［23]。相同的策略也被用于生產tRNA衍生物，可被分離的線粒體吸收［24]。這些RNA基元可以被構建成與線粒體疾病治療相關的新載體。

對于用于胞內藥物投遞的適配子，不僅要細胞攝取效率高，而且對于其吸收、分布、代謝和排泄等藥代動力學參數有一定的限制。Mi等［25]發(fā)展出基于SELEX的細胞攝取，用于活腫瘤動物模型的體內篩選。他們將隨機的RNA庫靜脈注射進肝癌移植小鼠中，循環(huán)20 min后，收集肝癌細胞后提取腫瘤細胞中的變異體，然后進行擴增，進而進行下一輪的注射。發(fā)現一個變異體對于腫瘤細胞的粗提物顯示出增強的親和力，而對正常的結腸細胞無親和性。然后他們將熒光標記的適配子進行尾部靜脈注射發(fā)現，適配子只定植于肝癌細胞，從而證實了該程序的可行性。最終的肽質量指紋圖譜鑒定分析結果顯示，得到的適配子能夠識別RNA解旋酶p68。

5 給藥系統(tǒng)開發(fā)

細胞結合適配子可以用于研發(fā)目標細胞特異性分子探針和進行藥物投遞系統(tǒng)的開發(fā)。Douglas等［26]使用DNA適配子進行藥物給藥研究。他們將藥物分子，主要是可與細胞表面結合的抗體，包裹在一個三維DNA紙盒（DNA origami box）中，適配子與其反義的DNA寡聚物雜交使盒子關閉。當細胞上的目標分子與適配子結合后，適配子構象改變使雜交解鏈，從而打開盒子，暴露出藥物。只有當細胞展示適配子的靶分子時，藥物才會暴露出來，這是一種高度特異性給藥系統(tǒng)。通過Cell-SELEX 技術得到的適配子在該系統(tǒng)中作為開關而存在。

另外，與細胞結合適配子也可用于開發(fā)細胞操作系統(tǒng)。例如，適配子固定的樹脂可被用于特定目標細胞的回收［27，28]。利用適配子的優(yōu)點是它們可以在溫和條件下，如反義雜交和二價陽離子的螯合作用下進行可逆失活。因此，可以在溫和條件下使用樹脂反復分離結合的細胞。同時，細胞特異性適配子還能夠用于特定細胞的粘附［29，30]。Schroeder等［31]開發(fā)出一個活細胞芯片，由肽配體和DNA芯片組成。靶細胞結合的肽配體與DNA寡聚物連接，通過雜交排列在DNA芯片上，當細胞加入芯片上后，靶細胞可通過與排列的肽配體親和附著在特定位置上。Gartner和Bertozzi 將多種類型的細胞進行空間排布，通過DNA雜交固定到細胞表面，這種細胞操作系統(tǒng)可用于細胞通訊研究［32]。

6 展望

適配子憑借其獨特的性質已應用于生物學和醫(yī)學研究中，利用Cell-SELEX技術，篩選得到的可與細胞結合的適配子應用程序為人們發(fā)展新的醫(yī)藥和生物技術打開了一扇新的大門，其作用是傳統(tǒng)的生物親和物抗體所不能實現的。Cell-SELEX技術提供一種高效的生產大量適配子的方法，這些適配子可作為探針特異性錨定各種癌細胞。適配子已用于癌細胞生物學研究的多個領域中，未來的研究也會演化更多的研究方向，如位點特異性化學修飾可使適配子與金納米顆?；蛄孔狱c交聯，使用比色或熒光的方法檢測癌細胞。由于具有較高的靈敏度，因此可以用于癌癥的早期診斷。同時，通過適配子對癌細胞的高度特異性，可以用于藥物靶向試劑的研發(fā)，從而得到低毒、高效的治療性藥物。另外，使用Cell-SELEX篩選的適配子可以釣取目的蛋白，用于新癌癥生物學標記物的發(fā)現。同時，也可作為調控子抑制或激活某些信號途徑從而進行癌癥發(fā)育研究。這種基于適配子的化學生物學方法也可以用于其他疾病的研究。不同的適配子可以特異的與各種不同類型的疾病細胞結合，未來的個性化用藥將成為現實。

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