李亞蘭 張全偉 王雪瑩 馬友記 張勇 趙興緒

胰島素樣生長(zhǎng)因子（Insulin-like growth factors，IGFs）是生長(zhǎng)激素（Growth hormone，GH）發(fā)揮作用的介質(zhì)，主要在肝臟中合成，具有促進(jìn)有絲分裂、誘導(dǎo)細(xì)胞分化、調(diào)節(jié)生長(zhǎng)等作用。IGFs包括IGF-1和IGF-2兩種同源多肽，兩個(gè)單鏈多態(tài)分子在氨基酸組成上同源性為62％，與胰島素原（Proinsulin）同源性為 50％［1，2］。1976年，Rinderknecht和 Humbel通過(guò)將NSILA測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了不同的生長(zhǎng)因子，由于它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上與胰島素非常相似，功能上也有部分相同，所以被正式命名為胰島素樣生長(zhǎng)因子1和胰島素樣生長(zhǎng)因子2（Insulin like growth factor，IGF-2）［3］。其中，IGF-2也被稱為生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素 A（Somatomedin A），剛轉(zhuǎn)錄出來(lái)的原始IGF-2是由156個(gè)氨基酸殘基組成的多肽鏈，經(jīng)過(guò)后續(xù)的剪切加工形成成熟的IGF-2，是由67 個(gè)氨基酸殘基組成的小分子弱酸性多肽。IGF2分子中包括了胰島素分子內(nèi)所有的半胱氨酸、賴氨酸及大多數(shù)非極性氨基酸，證明它們是由同一個(gè)祖蛋白進(jìn)化而來(lái)的［4］。IGF-2能促進(jìn)細(xì)胞的有絲分裂和分化，參與基因組重建，與X染色體的失活有重要關(guān)系［5］。此外，IGF2與個(gè)體脂肪沉淀、生長(zhǎng)速度等生產(chǎn)性能關(guān)系密切［6，7］，因此可作為影響牦牛肉質(zhì)性狀的候選基因。已有研究表明IGF-2基因有不依賴牦牛骨骼增長(zhǎng)而增加體重的作用［8］。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于IGF-2基因及其編碼的蛋白在人及一些動(dòng)物中已得到深入研究，但迄今尚未有牦牛IGF-2基因cDNA全序列的相關(guān)報(bào)道。

天祝白牦牛是分布于天祝縣境內(nèi)海拔3 000 m以上的優(yōu)勢(shì)牛種，也是高寒牧區(qū)人民的乳、肉等主要食品及皮毛、骨、角等生活用品的原料，在該地區(qū)具有不可替代的生態(tài)、社會(huì)和經(jīng)濟(jì)地位。本研究以天祝白牦牛為研究對(duì)象，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)獲得cDNA片段，利用cDNA末端快速擴(kuò)增（RACE）對(duì)IGF-2基因進(jìn)行克隆和分析，旨在為進(jìn)一步研究IGF-2基因的結(jié)構(gòu)和功能提供分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

組織樣本選自甘肅省天祝縣成年健康雄性牦牛，屠宰后馬上取其肝臟等臟器組織后放入液氮罐中帶回實(shí)驗(yàn)室，于-80℃超低溫冰箱中保存，備用。

RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×Power Taq PCR Master Mix、DNA Marker DL2000、DNA Marker DL500、膠回收試劑盒、pMD-19T載體、菌株E.coliDH5α均購(gòu)自百泰克生物公司（Bio-Take），3'RACE Kit2nd Generation、5'RACE Kit2nd Generation試劑盒購(gòu)自于寶生物公司（TaKaRa）。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank已發(fā)表的黃 牛（AY957981.1）、 羊（M89788.1）IGF-2基 因mRNA序列，利用Oligo 7設(shè)計(jì)天祝白牦牛IGF-2基因CDS區(qū)PCR引物。 根據(jù)RT-PCR獲得的CDS序列，分別設(shè)計(jì)5' RACE 和3' RACE的特異引物。引物的相關(guān)信息見(jiàn)表1。

表1 RT-PCR引物序列及參數(shù)

1.2.2 IGF-2基因CDS區(qū)擴(kuò)增及產(chǎn)物的克隆與測(cè)序 根據(jù)RNA提取試劑盒操作說(shuō)明，提取天祝白牦牛肝臟的總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA的純度和濃度，0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，-80℃保存。

取2μg總RNA根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明合成cDNA，反應(yīng)條件為 48℃，60min；70℃，10min。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)總體系為20μL ：cDNA 模板 1μL，上下游引物各 1μL（10μmol/μL），2×Power Taq PCR Master Mix 10μL，ddH2O補(bǔ)足20μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性4min；94℃45s，59℃ 45s，72℃ 1min，30 個(gè)循環(huán) ；72℃延伸10min，4℃保存。制作0.8％瓊脂糖檢測(cè)PCR產(chǎn)物，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收，回收產(chǎn)物與pMD19-T載體連接，之后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選挑取陽(yáng)性克隆，菌落PCR檢測(cè)的陽(yáng)性菌送上海生物工程有限公司測(cè)序。

1.2.3 IGF-2基因5'和3'端的序列擴(kuò)增 以總RNA為模板，按TaKaRa 5'-Full RACE Kit以及3'-FullRACE Kit說(shuō)明書(shū)步驟，擴(kuò)增天祝白牦牛IGF-2基因5'和3'端的序列，將PCR產(chǎn)物連接載體克隆，菌落PCR檢測(cè)的陽(yáng)性菌送上海生物工程有限公司測(cè)序。

1.2.4 IGF-2基因生物學(xué)分析 測(cè)序結(jié)果經(jīng)過(guò)人工校正后，用DNAMAN軟件進(jìn)行序列拼接。利用MegAlign（DNASTAR）將天祝白牦牛IGF-2基 因 與 牛（AY957981.1）、 羊（M89788.1）、 豬（HQ450757.1）、馬（ECILGF22）、人（XM005252900.1）、小鼠（NM_010514.3）、大鼠（NM_031511.2）等物種IGF-2 基因氨基酸序列分別進(jìn)行比對(duì)分析，用MAFFT在線軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)［9］。

2 結(jié)果

2.1 總RNA的提取

總RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，其紫外吸收值OD260/OD280為1.92；經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后可見(jiàn)28S和18S rRNA各一條帶，亮度比接近2∶1，表明本試驗(yàn)所提取的天祝白牦?？俁NA的純度和完整性較好，可以用于下一步RT-PCR。

2.2 天祝白牦牛IGF-2基因全長(zhǎng)cDNA擴(kuò)增及克隆測(cè)序

以天祝白牦牛肝臟組織為cDNA模板，將PTPCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1％瓊脂糖凝膠電泳顯示擴(kuò)增得到了長(zhǎng)度為500bp左右的片段，經(jīng)測(cè)序確定為544bp。5'RACE 和3'RACE分別獲得510bp和66bp的特異性條帶（圖1），經(jīng)測(cè)序?qū)Φ玫降男蛄衅唇?，除去冗余序列，得到天祝白牦牛IGF-2 cDNA序列長(zhǎng)為1060bp。

圖1 3'RACE（A）和5'RACE（B）擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.3 天祝白牦牛IGF-2基因cDNA序列分析

獲得的天祝白牦牛IGF-2基因長(zhǎng)1060bp，包括111bp的5'UTR，409bp的3'UTR，540bp的開(kāi)放閱讀框（ORF），起始密碼子ATG位于112 nt，終止密碼子TGA位于649 nt（圖2），該基因已提交至GenBank，獲得登錄號(hào)為：KF682139。

2.4 天祝白牦牛IGF-2基因蛋白序列分析

根據(jù)獲得的天祝白牦牛IGF-2基因編碼區(qū)核苷酸序列，推導(dǎo)出編碼179個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白，該蛋白氨基酸中含量最多的為Ala，占氨基酸總數(shù)的11.2％。經(jīng)ProtParam程序分析天祝白牦牛IGF-2蛋白的分子量為19.7kD，理論等電點(diǎn)（pI）為9.11，不穩(wěn)定系數(shù)為59.56，為不穩(wěn)定蛋白。SMART分析（圖2）表明，該蛋白第1-24位氨基酸為信號(hào)肽；第25-91位氨基酸為成熟肽，分為B、C、A、D四個(gè)區(qū)域；第112-166位氨基酸為結(jié)構(gòu)域。

2.5 天祝白牦牛IGF-2基因同源性比較

用DNAMAN軟件將天祝白牦牛翻譯后的氨基酸序列分別與GenBank中所報(bào)道的羊、黃牛、人、大鼠、小鼠和豬的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果（圖3）表明，天祝白牦牛IGF-2氨基酸序列與黃牛的同源性最高為94.4％；其次與羊的同源性為91.8％，與豬、人、大鼠和小鼠的同源性分別為85.9％、85.9％、82.3％、80.7％。進(jìn)化樹(shù)（圖4）分析表明，天祝白牦牛IGF-2 基因座位與黃牛和羊的親緣關(guān)系最近。

圖2 天祝白牦牛IGF-2基因cDNA序列及推導(dǎo)的氨基酸序列

圖3 天祝白牦牛與其他物種IGF-2氨基酸序列間多序列對(duì)位排列

圖4 IGF-2基因與其他物種系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

3 討論

本研究采用RACE技術(shù)首次成功地克隆得到了天祝白牦牛IGF-2基因編碼區(qū)的全長(zhǎng)cDNA，從該基因的核酸序列推斷出IGF-2蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)。試驗(yàn)得到的天祝白牦牛IGF-2基因 cDNA核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列經(jīng)NCBI Blast 序列比對(duì)，與已報(bào)道的牛、馬、人及小鼠等物種的 IGF-2 基因具有高度的同源性，說(shuō)明IGF- 2 基因具有高度的保守性。參照人和其他哺乳動(dòng)物的IGF-2結(jié)構(gòu)，推測(cè)所克隆得到的天祝白牦牛IGF-2的氨基酸序列分為信號(hào)肽、B、C、A、D和結(jié)構(gòu)域 6個(gè)區(qū)域，A 和B 結(jié)構(gòu)域與胰島素原具有極高的同源性，這些結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)對(duì)于受體和結(jié)合蛋白識(shí)別IGF-2很重要［10］。成熟肽B、C、A、D 4個(gè)區(qū)域，共有6個(gè)半胱氨酸殘基，可形成3對(duì)二硫鍵（33-71，45-84，70-75），對(duì)維持IGF-2的空間結(jié)構(gòu)起重要作用。從這些結(jié)果可以看出IGF-2基因在進(jìn)化上的保守性。IGF-2是目前研究 較多的印跡基因之一，目前，IGF-2已在人、鼠、羊、豬和牛等物種被確定為印記基因，且正常情況下大多數(shù)組織均為母源印記［11，12］，即父源等位基因表達(dá)。IGF-2基因在其他哺乳動(dòng)物中是否存在基因印跡現(xiàn)象，是否也是父源等位基因基因，都有待于進(jìn)一步的研究。

近年來(lái)，家畜經(jīng)濟(jì)價(jià)值的研究受到廣泛關(guān)注，牦牛作為一種重要的經(jīng)濟(jì)物種，其肉、毛 奶等具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值［13］。由于牦牛生存環(huán)境受到多種因素（低氧、寒冷、放牧周期短等）的影響［14-16］，其生長(zhǎng)可能被抑制。IGF-2作為牦牛肉質(zhì)研究的候選基因，其結(jié)構(gòu)和功能的研究具有重要的意義。IGF-2是一種多功能細(xì)胞增殖調(diào)控因子，在細(xì)胞的分化，增殖、胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育以及腫瘤細(xì)胞增殖中具有重要的促進(jìn)作用［17］，通過(guò)促進(jìn)牦牛骨骼發(fā)育和肌肉增長(zhǎng)，從而增加其產(chǎn)肉量，達(dá)到提高其經(jīng)濟(jì)價(jià)值的效果［14］。本研究對(duì)IGF-2結(jié)構(gòu)研究及其功能的預(yù)測(cè)，為進(jìn)一步對(duì)IGF-2功能研究奠定基礎(chǔ)，為牦牛經(jīng)濟(jì)價(jià)值開(kāi)發(fā)提供參考和理論依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究運(yùn)用同源序列克隆技術(shù)結(jié)合RACE技術(shù)，獲得全長(zhǎng)1060bp天祝白牦牛IGF-2基因的cDNA，并對(duì)其氨基酸與編碼氨基酸序列特性進(jìn)行了研究。該基因的成功克隆為進(jìn)一步研究牦牛IGF-2基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

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