張龍崗，楊玲，劉羽清 董學(xué)颯，朱永安，付佩勝 （山東省淡水漁業(yè)研究院，山東省淡水水產(chǎn)遺傳育種重點實驗室，山東 濟南 250117）

克氏原螯蝦 （Procambarus clarkii）隸屬螯蝦科原螯蝦屬，是淡水螯蝦的一個種，俗稱淡水小龍蝦［1］?？耸显r原產(chǎn)于美國南部和墨西哥北部，20世紀30年代末由日本引入到中國?？耸显r肉味鮮美，高蛋白質(zhì)低脂肪，鈣、磷、鐵質(zhì)含量豐富。自1983年中國科學(xué)院動物研究所戴愛云研究員首次提倡開發(fā)利用淡水螯蝦以來，克氏原螯蝦已成為我國重要的水產(chǎn)資源，現(xiàn)已廣泛分布于我國東部和中部地區(qū)十余個省市，甚至已成為一些湖泊和溝渠的優(yōu)勢種群［2］。

Barbaresi等［3］利用隨機擴增多態(tài)性DNA標記 （RAPD）對歐洲5個克氏原螯蝦群體進行了遺傳變異分析，結(jié)果顯示5個群體具有高度的遺傳變異，揭示了引入的克氏原螯蝦群體來源于不同的地域。Barbaresi等［4］利用線粒體DNA測序技術(shù)和微衛(wèi)星技術(shù)對西歐和北美的12個克氏原鰲蝦群體進行了分析，探明了克氏原螯蝦在西歐的遷移路線。目前，國內(nèi)學(xué)者對克氏原螯蝦的群體遺傳學(xué)研究也已開展，Yue等［5］利用mtDNACOI序列和5個微衛(wèi)星位點探討了江蘇南京和浙江桐鄉(xiāng)克氏原螯蝦群體的遺傳結(jié)構(gòu)；劉煒［6］利用7個微衛(wèi)星位點探討了東部地區(qū)6個克氏原螯蝦群體的遺傳多樣性及各群體間的親緣關(guān)系。王長忠等［7］利用17個微衛(wèi)星標記對長江下游地區(qū)4個克氏原螯蝦群體進行了遺傳多樣性研究。本研究利用12對RAPD引物對山東地區(qū)3個克氏原螯蝦地理群體的遺傳差異狀況及遺傳結(jié)構(gòu)進行了本底調(diào)查，以期為有針對性地開展克氏原螯蝦資源保護和遺傳育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

克氏原螯蝦野生群體樣本于2012年4～6月分別采自于山東微山湖 （WS）、東平湖 （DP）以及濟南小清河 （JN），每個群體樣本數(shù)量均為30尾。

1.2 基因組DNA的提取

取100mg樣品低溫下剪碎并研磨為糊狀，采用生工生物工程 （上海）股份有限公司的UNIQ－10柱式動物基因組DNA抽提試劑盒提取總DNA，并用1.0%的瓊脂糖電泳檢測純度，－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR擴增

在生工生物工程 （上海）股份有限公司合成200條隨機引物，用于PCR擴增。PCR總反應(yīng)體積為25μl，反應(yīng)體系為：10×buffer 2.5μl，25mmol／L 的 MgCl22μl，2.5mmol／L 的 dNTP 2μl，引 物（10μm／L）為1μl，DNA模板1μl，Taq酶 （TaKaRa，5U／μl）0.2μl，其余由滅菌雙蒸水補足至終體積。擴增程序為：94℃預(yù)變性2min，然后進行35個循環(huán) （94℃1min，36℃1min，72℃1min），72℃延伸5min。擴增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳法檢測，凝膠成相系統(tǒng)觀察、照相。

1.4 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)觀察結(jié)果，記錄清晰、明亮且重復(fù)性好的條帶。將相同遷移距離的條帶看作同一位點，統(tǒng)計總條帶數(shù)，多態(tài)性條帶數(shù)。根據(jù)RAPD產(chǎn)物的電泳帶型，在相同的遷移率上，出現(xiàn)帶的記為1，沒有出現(xiàn)帶的記為0。構(gòu)建原始數(shù)據(jù)庫矩陣，并據(jù)此統(tǒng)計位點總數(shù)和多態(tài)位點比例，采用NTsys－pc 2.02軟件進行遺傳相似性系數(shù)和遺傳距離的分析，并進行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA抽提結(jié)果

經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠檢測，可以看出DNA模板比較純凈單一，沒有雜帶出現(xiàn)，條帶清晰，濃度和純度基本符合RAPD擴增要求。

2.2 RAPD擴增結(jié)果

本研究使用200條隨機引物對取自濟南小清河、微山湖和東平湖3個不同地理群體的30只克氏原螯蝦進行RAPD分析。按照條帶清晰且多態(tài)性豐富、重復(fù)性好、條帶數(shù)量適中的原則，共挑選出12個隨機引物 （表1）。12個隨機引物共擴增出118個位點（平均每條引物產(chǎn)生8～12個位點），其片段大小為200～2000bp，其中多態(tài)位點共計48個 （多態(tài)片段的比例為40.68% ）。

圖1 制備的克氏原螯蝦DNA凝膠成像圖

表1 篩選出的12個隨機引物序列及其擴增的條帶數(shù)

2.3 群體內(nèi)與群體間的遺傳相似系數(shù)及遺傳距離

通過統(tǒng)計各群體30只個體間共有的RAPDs，計算得群體間的遺傳相似系數(shù)和遺傳距離。表2表明，群體內(nèi)的遺傳相似系數(shù) （0.9023～0.9411）明顯大于群體間的遺傳相似系數(shù) （0.6845～0.7973），說明群體間的遺傳差異要大于群體內(nèi)的遺傳差異。與其他群體相比，微山群體內(nèi)的遺傳變異程度較大，其次是東平群體，濟南小清河群體內(nèi)的變異度最小。微山湖和東平湖群體間的遺傳相似系數(shù)最高 （0.7973），遺傳距離最小 （0.2027），說明這2個群體的親緣關(guān)系最近。濟南小清河和微山湖群體間的遺傳相似系數(shù)最小 （0.6845），遺傳距離最高 （0.3155），說明2個群體的親緣關(guān)系較遠。

2.4 群體聚類分析

基于Nei′s遺傳距離對3個克氏原螯蝦群體構(gòu)建UPGMA聚類樹 （圖2）。表明，微山湖群體與東平湖群體聚為一支，濟南小清河群體單獨聚為一支。

表2 3個地理群體的遺傳相似系數(shù)及群體間的遺傳距離

3 討論

克氏原螯蝦遺傳多樣性的研究不僅對于野生物種的遺傳資源的保護及苗種的選育具有重要的意義［8］，而對不同地理群體的特性及相互間差異的了解則是遺傳育種的基礎(chǔ)［9］。本研究利用RAPD標記技術(shù)研究了山東省克氏原螯蝦3個地理群體 （微山湖、東平湖、濟南小清河）的遺傳多樣性，結(jié)果表明，濟南小清河群體的遺傳多樣性最低，其次是東平湖群體，微山湖群體的遺傳變異最大。本研究沒有找出區(qū)分克氏原螯蝦3個地理群體的特征性條帶，很可能是所篩選的引物還不足以找出這樣的特征帶，對此還有必要進一步探討。

遺傳相似系數(shù)是衡量群體遺傳變異程度的可靠參數(shù)，群體間的親緣關(guān)系越近則遺傳變異性就越低，相似系數(shù)值就越大［10］。濟南小清河群體內(nèi)的遺傳相似系數(shù) （0.9411）要高于微山湖 （0.9023）和東平湖群體 （0.9325），說明其群體內(nèi)個體間的差異較小，純度較高，遺傳多樣性偏低，也反映出近年來濟南小清河群體因酷漁濫捕對其群體資源的影響較大，造成其群體內(nèi)多態(tài)性有所下降，可利用的遺傳變異減少。

遺傳距離是反映群體遺傳變異程度的尺度，常常用來分析群體間的親緣關(guān)系和遺傳變異程度，遺傳距離越大表明群體間親緣關(guān)系就越遠。濟南小清河和微山湖群體間的遺傳距離最高 （0.3155），說明2個群體的親緣關(guān)系較遠?；贜ei′s遺傳距離對3個克氏原螯蝦群體構(gòu)建的UPGMA聚類樹也表明，微山湖群體與東平湖群體親緣關(guān)系較近，與濟南小清河群體親緣關(guān)系較遠。分析可能是因為隨著近年來小龍蝦產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展，尤其微山湖和東平湖一帶小龍蝦養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展較快，每年都有大量來自長江流域的小龍蝦苗種引入，人為因素的介入使得微山湖群體與東平湖群體與外界存在著頻繁的基因交流。而濟南小清河群體環(huán)境相對封閉，與其他群體缺乏基因交流，與其他群體的親緣關(guān)系較遠，而獨立成組。

目前，對于克氏原螯蝦功能基因方面的信息了解還不多，下一步需對克氏原螯蝦多態(tài)性序列進行大批量的測序分析，最終將其定位在某條染色體或某個功能基因上，通過基因工程的方法，培育出具有優(yōu)良性狀的品種，以促進克氏原螯蝦養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展。

圖2 UPGMA聚類分析法構(gòu)建的3個群體克氏原螯蝦的分子系統(tǒng)樹

［1］沈嘉瑞.我國的蝦類 ［M］.北京：科學(xué)出版社，1976.

［2］王衛(wèi)民.軟殼克氏原螯蝦在我國開發(fā)利用前景 ［J］.水生生物學(xué)報，1999，23（4）：375－381.

［3］Barbaresi S，F(xiàn)ani R，Gherardi F，et al.Genetic variability in European populations of aninvasive American crayfish：preliminary results［J］.Biological Invasions，2003，5：269－274.

［4］Barbaresi S，F(xiàn)ani R，Gherardi F，et al.Genetics and invasion biology in fresh waters：apilot study of Procambarus clarkii in Europe［J］.Biological Invaders in Inland Waters：Profiles Distribution and Threats，2007，4：381－400.

［5］YUE G H，WANG G L，ZHU B Q，et al.Discovery of four natural clones in a crayfish species Procambarus clarkii ［J］.International Journal of Biological Sciences，2008，4：279－282.

［6］劉煒.克氏原螯蝦肌肉肌苷酸含量及遺傳多樣性研究 ［D］.揚州：揚州大學(xué)，2008.

［7］王長忠，李忠，梁宏偉，等.長江下游地區(qū)4個克氏原螯蝦群體的遺傳多樣性分析 ［J］.生物多樣性，2009，17（5）：518－523.

［8］黃羽.鄱陽湖流域克氏原螯蝦的資源狀況及長江中下游克氏原螯蝦遺傳多樣性研究 ［D］南昌：南昌大學(xué)，2012.

［9］張瑋.克氏原螯蝦4個地理群體遺傳差異的RAPD分析 ［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（22）：11861－11862，11876.

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