沈梅紅 沈 潔 舒兆瑞 張 瑩 穆艷云 李忠仁

(南京中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210023)

氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)是缺血性中風(fēng)的重要機(jī)制之一，而電針對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠具有明顯的抗氧應(yīng)激保護(hù)作用〔1〕。紅系核因子2(NF-E2)相關(guān)因子(Nrf2)目前認(rèn)為是調(diào)控細(xì)胞對(duì)抗外來(lái)異物和氧化損傷的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。Nrf2缺失或激活障礙，會(huì)引起細(xì)胞對(duì)應(yīng)激源的敏感性增高，與細(xì)胞凋亡、炎癥修復(fù)進(jìn)程延長(zhǎng)、化學(xué)促癌的發(fā)生等病變過(guò)程密切相關(guān)〔2〕。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)Nrf2在氧化應(yīng)激性疾病中起著重要的調(diào)控作用，Nrf2的激活可誘導(dǎo)一系列內(nèi)源性抗氧化酶和抗氧化蛋白上調(diào)，參與γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GCS)的基礎(chǔ)性和誘導(dǎo)性表達(dá)〔3〕，協(xié)同加強(qiáng)細(xì)胞清除ROS/RNS的防御系統(tǒng)，維持細(xì)胞內(nèi)的還原電位。但大鼠局灶性腦缺血再灌注后Nrf2表達(dá)狀態(tài)尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究擬利用大腦中動(dòng)脈缺血再灌注大鼠模型，采用免疫組化方法觀察缺血再灌注損傷后大腦皮層細(xì)胞上Nrf2蛋白表達(dá)情況，并探索電針干預(yù)作用的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1藥品與試劑 多聚甲醛 (分析純，批號(hào)：20071217)：購(gòu)自成都科龍化學(xué)試劑廠，用0.01 mol/L PBS緩沖液配成4％濃度備用；一抗(Nrf2兔抗大鼠單克隆抗體)購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司(批號(hào)：K2008，用抗體稀釋液1∶150稀釋)；二抗及免疫組化測(cè)試盒(SABC)購(gòu)于武漢博士德公司；多聚賴氨酸及DAB顯色液等免疫組化輔助試劑購(gòu)于福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 15只清潔級(jí)Sprague Dawley健康雄性大鼠，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司(許可證號(hào)：SCXK(滬)2007-0005)，所有大鼠均自由攝食、飲水，生活在晝夜節(jié)律為12 h/12 h且保持一定濕度和25℃的空間內(nèi)。適應(yīng)性喂養(yǎng)至體重(300±20)g后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器 Olympus BX50生物組織顯微鏡(日本)；Olympus DP71圖像獲取系統(tǒng)(日本)；JD801形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)軟件(江蘇省捷達(dá)科技發(fā)展有限公司)；WQ1002K電針儀(安隆光電技術(shù)公司)。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組、模型制備及電針治療方法 根據(jù)數(shù)字隨機(jī)表將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組大鼠(n=5)和造模大鼠(n=10)，后者采用改良Longa線栓大腦中動(dòng)脈法制作局灶性腦缺血再灌注模型，將神經(jīng)缺損綜合評(píng)分為2分以上大鼠隨機(jī)分為缺血再灌注模型組(模型組)、腦缺血再灌注模型+電針“百會(huì)”、“大椎”穴組(電針組)，每組5只 。假手術(shù)組大鼠的手術(shù)過(guò)程，除不插入線栓外其余步驟與模型組大鼠一致。

缺血2 h再灌注開(kāi)始即刻對(duì)電針組大鼠施以麻醉狀態(tài)下的電針治療。按經(jīng)絡(luò)循行及神經(jīng)節(jié)段分布特點(diǎn)，依據(jù)中國(guó)中醫(yī)藥出版社《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》(2007年出版)所附動(dòng)物穴位圖譜選取“百會(huì)”、“大椎”穴。采用華佗牌不銹鋼一次性毫針(F 0.30 mm×25 mm)進(jìn)行針刺操作，“百會(huì)”穴平刺，“大椎”穴約30°角斜刺，深度均為10 mm。刺激參數(shù)：連續(xù)波，刺激強(qiáng)度以針柄輕微顫動(dòng)、大鼠穴位局部抖動(dòng)，大鼠不嘶叫為宜 (頻率：3 Hz，電流強(qiáng)度：1～3 mA)。持續(xù)電刺激30 min。模型組與假手術(shù)組大鼠施以相同麻醉，但不進(jìn)行電針治療。

1.2.2免疫組織化學(xué)法觀察Nrf2蛋白表達(dá)情況 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物再灌注24 h后，經(jīng)水合氯醛麻醉后開(kāi)胸腹，先后用生理鹽水、4％多聚甲醛固定液灌流，并固定過(guò)夜后，將大腦沿冠狀面切成5等份腦片，取尾側(cè)第2片腦組織。經(jīng)常規(guī)石蠟包埋、切片(每片厚5 μm)后，每只動(dòng)物取1張組織切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，方法按Nrf2蛋白免疫組化測(cè)試盒操作說(shuō)明進(jìn)行操作。經(jīng)脫水、透明和封片后，光學(xué)顯微鏡觀察大腦皮層錐體細(xì)胞層細(xì)胞改變，并用Olympus顯微圖像獲取系統(tǒng)400倍拍攝圖像。每張切片隨機(jī)觀察5個(gè)視野，計(jì)算每只動(dòng)物的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取平均值，即為該組動(dòng)物該區(qū)域的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。采用圖像分析系統(tǒng)測(cè)定視野中陽(yáng)性細(xì)胞的平均灰度、平均光密度，以評(píng)估Nrf2蛋白陽(yáng)性細(xì)胞的Nrf2含量變化。

2 結(jié) 果

2.1光鏡觀察圖 光鏡下觀察，大鼠大腦皮層Nrf2蛋白免疫組化反應(yīng)顯色呈棕黃色，陽(yáng)性細(xì)胞分布于皮層分子層外的各個(gè)細(xì)胞層，以錐體細(xì)胞層表達(dá)明顯，表達(dá)部位主要位于胞質(zhì)和核膜上。假手術(shù)組偶見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞，著色褐黃色；模型組錐體細(xì)胞層表達(dá)Nrf2細(xì)胞數(shù)增多，著色稍深；而電針組免疫陽(yáng)性細(xì)胞分布密集，胞體大，著色深，胞質(zhì)和胞核均有表達(dá)。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠皮層錐體細(xì)胞層Nrf2蛋白表達(dá)(×400)

2.2大腦皮層Nrf2蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的觀察 假手術(shù)組、模型組大鼠大腦皮層均可檢測(cè)到Nrf2蛋白陽(yáng)性細(xì)胞，其中模型組大鼠大腦皮層表達(dá)Nrf2蛋白的細(xì)胞數(shù)(34.25±6.34)較假手術(shù)組(19.00±6.27)升高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。電針組大腦皮層中可見(jiàn)到大量的Nrf2蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(84.20±14.18)，與模型組、假手術(shù)組相比均有顯著性差異。

2.3電針對(duì)大腦皮層表達(dá)Nrf2蛋白陽(yáng)性細(xì)胞的影響 與假手術(shù)組相比，模型組大腦皮層錐體細(xì)胞層的Nrf2蛋白陽(yáng)性細(xì)胞的平均灰度有下降趨勢(shì)，平均光密度有上升的趨勢(shì)；電針組的平均灰度明顯低于模型組，平均光密度明顯高于模型組。見(jiàn)表1。

表1 電針對(duì)大腦皮層Nrf2蛋白陽(yáng)性細(xì)胞平均灰度、平均光密度的影響

3 討 論

研究表明〔2～4〕，作為一種轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子 2(Nrf2)和胞質(zhì)接頭蛋白(Keap1)是細(xì)胞抗氧化反應(yīng)中樞調(diào)節(jié)者。生理狀態(tài)下兩者結(jié)合，Nrf2活性處于相對(duì)抑制狀態(tài)，半衰期短，約為20 min，經(jīng)泛素化可快速降解。在氧化應(yīng)激源作用下，因Keap1在C273、C288、C157部位存在巰基(-SH)，易失去電子，形成二硫鍵(-S-S-)，從而使Keap1構(gòu)型發(fā)生改變，引起Nrf2與keap1解偶連后，Nrf2穩(wěn)定性增加并激活，轉(zhuǎn)移入核，與抗氧化反應(yīng)元件(ARE)上GCTGAGTCA位點(diǎn)結(jié)合，調(diào)節(jié)絕大多數(shù)抗氧化基因的表達(dá)抗氧化酶基因表達(dá)，增加細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激抗性。Nrf2通過(guò)與Keap1的相互作用，感受細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)的變化，特別是細(xì)胞內(nèi)巰基量的變化。Nrf2通過(guò)與ARE相互作用，誘導(dǎo)編碼抗氧化蛋白表達(dá)，是細(xì)胞抗氧應(yīng)激防御保護(hù)中關(guān)鍵一步。Keap1-Nrf2/ARE通路在抗應(yīng)激、調(diào)節(jié)GSH合成、抗凋亡、抗炎癥反應(yīng)、神經(jīng)保護(hù)等方面發(fā)揮著廣泛細(xì)胞保護(hù)功能。Nrf2/ARE信號(hào)通路的激活可誘導(dǎo)一系列內(nèi)源性的細(xì)胞保護(hù)基因上調(diào)，其中包括一系列的抗氧化酶和抗氧化蛋白，這些酶類和蛋白可通過(guò)催化自由基轉(zhuǎn)化為無(wú)毒物質(zhì)和增加其水溶性，利于自由基排除，可協(xié)同加強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化防御系統(tǒng)。Rubiolo〔5〕利用H2O2刺激大鼠肝臟原代細(xì)胞，認(rèn)為Nrf2可促進(jìn)SOD、CAT的表達(dá)。Kim等〔6〕把老年大鼠的樹(shù)突狀細(xì)胞移植到年青大鼠會(huì)導(dǎo)致年輕大鼠免疫能力下降，但是將經(jīng)Nrf2激動(dòng)劑體外刺激來(lái)源于衰老大鼠的樹(shù)突細(xì)胞移植到年青鼠則可以提高其抗氧化酶和GSH合成能力。而Nrf2缺失或激活障礙，可加重氧化應(yīng)激源細(xì)胞毒性，導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙、凋亡甚至死亡。如Kim等〔7〕發(fā)現(xiàn)在耐三苯氧胺藥的肺癌細(xì)胞中谷胱甘肽 (GSH)和細(xì)胞核的Nrf2含量均高于普通肺癌細(xì)胞，但把Nrf2顯性負(fù)相的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)耐藥的肺癌細(xì)胞時(shí)，發(fā)現(xiàn)GSH含量大幅度下降，直接證明Nrf2是GSH的表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子。

Yang等〔8〕在大鼠局部腦缺血后給予注射Nrf2激動(dòng)劑-姜黃后，Nrf2、HO-1mRNA和蛋白水平均明顯升高，并能有效地減小梗死區(qū)域、降低腦組織水腫、改善神經(jīng)功能評(píng)分。前期研究〔1，9〕表明，腦缺血再灌注時(shí)腦組織內(nèi)GSH含量及GSH-Px、GR活性均下降，機(jī)體表達(dá)γ-GCSh mRNA、γ-GCSl mRNA和γ-GCS蛋白能力無(wú)明顯提高；而電針可促進(jìn)大腦皮層中GCSh和GCSl拷貝數(shù)增加和錐體細(xì)胞表達(dá)大量的γ-GCS蛋白，從而提高GSH含量及GSH-Px、GR活性促進(jìn)機(jī)體谷胱甘肽系統(tǒng)清除氧自由基。

本研究表明在大腦缺血再灌注時(shí)產(chǎn)生的氧化應(yīng)激，可誘導(dǎo)大腦皮層表達(dá)少量的Nrf2蛋白。而給予“百會(huì)”、“大椎”兩穴的電針刺激后，Nrf2蛋白明顯增加，結(jié)合前期研究結(jié)果推測(cè)電針可通過(guò)增加Nrf2蛋白質(zhì)的表達(dá)來(lái)發(fā)揮其調(diào)節(jié)抗氧化酶γ-GCS水平繼而調(diào)節(jié)GSH-Px、GR及GSH含量最后達(dá)到保護(hù)機(jī)體免受自由基損傷的目的。

4 參考文獻(xiàn)

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