楊振軍 劉東慧 宋成軍 陳志宏

(承德醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，河北 承德 067000)

結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)是與促進(jìn)纖維化和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)沉積密切相關(guān)的細(xì)胞因子，可通過促進(jìn)ECM沉積在腎小管間質(zhì)纖維化、腎小球硬化等方面發(fā)揮重要作用〔1〕。人體的多種組織器官，如心血管系統(tǒng)、腦、肝臟、骨骼肌、消化道、腎臟和胰腺等均發(fā)現(xiàn)有CTGF存在，其中腎臟的含量最高，但在生理情況下CTGF的表達(dá)水平很低〔2〕。目前，治療糖尿病多采用控制飲食、運(yùn)動(dòng)、口服降糖藥物、注射胰島素等方法，但上述方法均有其治療的局限性，并且均不能有效改善胰島素抵抗及保護(hù)胰島細(xì)胞〔3,4〕。根據(jù)民間蠶繭泡水輔助降糖的用法，本課題組進(jìn)行了初步探討，發(fā)現(xiàn)絲膠可有效降低血糖、改善糖尿病時(shí)血脂代謝紊亂及保護(hù)糖尿病時(shí)生殖功能障礙〔5,6〕。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物、分組及處理 48只清潔級(jí)健康雄性SD大鼠，體重200～250 g，購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：712024。隨機(jī)選取其中的12只作為正常對(duì)照組，常規(guī)飼養(yǎng)，腹腔注射同等劑量鏈脲佐菌素(STZ)溶劑3次(1次/d)；其余的36只大鼠按25 mg/kg的劑量連續(xù)3 d腹腔注射2％的STZ，成模標(biāo)準(zhǔn)是注射STZ 1 w后空腹血糖(FPG)≥16.7 mmol/L〔7〕。成功建立2型糖尿病模型的大鼠隨機(jī)分為糖尿病模型組、絲膠治療組和陽(yáng)性對(duì)照組，每組12只，絲膠治療組大鼠按照2.4 g·kg-1·d-1的劑量灌胃給予絲膠35 d，陽(yáng)性對(duì)照組大鼠灌胃給予二甲雙胍(55.33 mg·kg-1·d-1)35 d，正常對(duì)照組、模型組大鼠灌胃給予等容積生理鹽水35 d。

1.2藥物和試劑 絲膠(承德醫(yī)學(xué)院蠶業(yè)研究所)：浸泡后水煎2次，合并濾液并濃縮。STZ美國(guó)Sigma公司，用枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液(pH4.4)配制；血糖檢測(cè)試劑盒，保定長(zhǎng)城臨床試劑有限公司；纖維連接蛋白酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒，南京建成生物工程研究所；兔抗CTGF多克隆抗體，北京博奧森生物技術(shù)有限公司；辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(二抗)，美國(guó)KPL公司；BCA蛋白定量試劑盒、藍(lán)色預(yù)染蛋白質(zhì)Marker、蛋白裂解液、1 200 bp DNA Ladder，北京泰格美科技有限公司；β-actin單克隆抗體，美國(guó)Santa公司；Trizol，美國(guó)Invitrogen公司；CTGF、β-actin引物，上海生工公司；PCR試劑盒，大連寶生物工程有限公司。

1.3檢測(cè)血液指標(biāo) 4％水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，經(jīng)內(nèi)眥取血，3 000 r/min離心20 min后收集血清，-20℃冰箱保存。葡萄糖氧化酶法檢測(cè)血糖，ELISA法檢測(cè)纖維連接蛋白含量。

1.4大鼠腎臟CTGF表達(dá)的檢測(cè) 大鼠取血后斷頭處死，取腎臟入液氮保存。

1.4.1Western 印跡法檢測(cè)CTGF蛋白的表達(dá) 取液氮保存腎臟提取蛋白，BCA蛋白定量試劑盒定量蛋白濃度。每個(gè)上樣孔加80 μg總蛋白行12％ SDS-PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜；5％脫脂奶粉37℃封閉1 h，加一抗(β-actin 1∶1 000、CTGF 1∶100)于4℃過夜；洗膜后加入辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶5 000)室溫?fù)u床孵育1 h，洗膜后加入Super ECL Plus超敏發(fā)光液，曝光后掃描。以β-actin為內(nèi)參照，采用Quantity One-v 4.6.2軟件對(duì)Western條帶進(jìn)行定量分析，以目的蛋白條帶與β-actin條帶的灰度比值，作為CTGF蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.4.2RT-PCR法檢測(cè)CTGF mRNA的表達(dá) 取液氮保存腎臟，按Trizol試劑說(shuō)明提取腎臟總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，產(chǎn)物進(jìn)行PCR。PCR引物序列：CTGF正義鏈:5’- CCTACCGACTGGAAGACACATT-3’，反義鏈:5’-GATGCACTTTTTGCCCTTCTTA-3’，退火溫度56℃，循環(huán)次數(shù)：30次，產(chǎn)物大小230 bp；β-actin正義鏈:5’-GAGGGAAATCGTGCGTGAC-3’，反義鏈:5’-CTGGAAGGTGGACAGTGAG’-3，退火溫度55℃，循環(huán)次數(shù)：29次；產(chǎn)物大小445 bp。PCR反應(yīng)體系50 μl，取5 μl擴(kuò)增產(chǎn)物及5 μl DNA Ladder行2％瓊脂糖凝膠電泳(90 V，40 min)，ZF型紫外透射反射分析儀攝像，應(yīng)用Quantity One-v 4.6.2軟件進(jìn)行分析，以目的條帶和β-actin條帶吸光度的比值，作為CTGF mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件，多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠腎臟CTGF的表達(dá) 模型組大鼠腎臟CTGF蛋白及mRNA的表達(dá)較正常對(duì)照組大鼠高(P<0.01)；絲膠、二甲雙胍均可明顯降低糖尿病模型大鼠腎臟CTGF的表達(dá)，絲膠治療組、陽(yáng)性對(duì)照組大鼠腎臟CTGF蛋白及mRNA的表達(dá)明顯較模型組大鼠低(P<0.01，P<0.05)。見圖1，圖2、表1。

圖1 大鼠腎臟CTGF mRNA的表達(dá)

2.2各組大鼠的血糖和血清纖維連接蛋白的含量 與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠的血糖、纖維連接蛋白的含量明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，絲膠治療組、陽(yáng)性對(duì)照組大鼠的血糖和纖維連接蛋白的含量明顯降低(P<0.01)。見表1。

1.正常對(duì)照組，2.模型組，3.絲膠治療組，4.陽(yáng)性對(duì)照組,下圖同

與模型組比較：1) P<0.01,2) P<0.05

3 討 論

有研究發(fā)現(xiàn)，3～5個(gè)月的糖尿病大鼠，腎小球和整個(gè)腎皮質(zhì)CTGF mRNA的表達(dá)均明顯增加〔8〕；本研究也證實(shí)了這一點(diǎn)，糖尿病模型大鼠腎臟CTGF蛋白和mRNA的表達(dá)水平明顯升高。糖尿病時(shí)，高血糖、晚期糖基化終末產(chǎn)物、血管緊張素Ⅱ、5-羥色胺等均可導(dǎo)致腎臟CTGF表達(dá)水平的升高〔9,10〕。CTGF表達(dá)上調(diào)后，一方面通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的活性打破MMPs/TIMPs的平衡，使ECM合成和降解的平衡失調(diào)，從而引發(fā)腎間質(zhì)纖維化〔11,12〕；另一方面，CTGF可在許多方面介導(dǎo)TGF-β1的致腎臟纖維化作用〔13〕。CTGF作為介導(dǎo)TGF-β1致纖維化的因子，可通過促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂和TGF-β1的作用，使ECM成分合成增加、降解減少，進(jìn)而導(dǎo)致腎臟肥大、腎小球硬化以及腎小管纖維化〔14〕。研究資料顯示，應(yīng)用轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1和CTGF刺激細(xì)胞能加速ECM合成，而降低TGF-β1和CTGF的表達(dá)，可通過減少ECM合成保護(hù)腎臟損傷〔15,16〕。本研究發(fā)現(xiàn)，絲膠可明顯降低糖尿病模型大鼠血清ECM成分纖維連接蛋白的含量，降低糖尿病模型大鼠腎臟CTGF的表達(dá)。本研究表明，絲膠可通過下調(diào)CTGF的表達(dá)，一方面恢復(fù)糖尿病時(shí)腎臟MMPs/TIMPs的平衡狀態(tài)，另一方面拮抗CTGF介導(dǎo)的TGF-β1的致腎臟纖維化的作用；因此，絲膠可通過減少ECM的合成恢復(fù)ECM合成和降解的平衡，延緩腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展，發(fā)揮對(duì)糖尿病腎臟損傷的保護(hù)作用。本研究為進(jìn)一步開發(fā)利用蠶繭治療糖尿病及其并發(fā)癥提供了可靠的實(shí)驗(yàn)資料。由于絲膠是天然的蛋白質(zhì)，可避免化學(xué)合成藥物帶來(lái)的毒副作用，值得進(jìn)一步探討絲膠治療糖尿病及其并發(fā)癥的相關(guān)作用及機(jī)制。

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