李紅軍 李勇莉 劉 棟 王杰玉 李晉雪 王國棟 高福蓮

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，河南 新鄉(xiāng) 453003)

哺乳動物的心臟有內(nèi)在修復和再生的潛力〔1〕，無論在正常還是病理情況下均有心肌細胞處于分裂周期。心肌干細胞(CSCs)是多能干細胞，存在于成體心臟的、具有高度自我更新和特異性心肌分化、增殖能力的未分化細胞，具有酪氨酸激酶受體(c-Kit)、多藥耐藥基因1蛋白(MDR1)和干細胞抗原(Sca-1)等多能干細胞的表面標志，譜系標記物陰性。有研究證實經(jīng)靜脈注射有些細胞因子于急性心肌梗死的小鼠后，CSCs在外周血和心肌梗死區(qū)增多，參與心肌修復〔2〕，應用CSCs治療心肌梗死成為心血管病領(lǐng)域的研究熱點〔3〕。本研究通過檢測小鼠成體固有心房、心耳、左心室、右心室和室間隔c-Kit、MDR1、增殖細胞核抗原(PCNA)的表達，探討這些部位的c-Kit、MDR1、PCNA的表達有無差異。

1 材料和方法

1.1實驗動物 近交系BALB/C 6只，雌性，體重38～40 g，來源于國家嚙齒類實驗動物種子中心上海分中心，SPF級。

1.2主要試劑與儀器 兔抗人c-Kit多克隆抗體、鼠抗人PCNA單克隆抗體、即用型SABC免疫組化染色試劑盒和DAB顯色試劑盒均購自武漢Boster公司，多聚賴氨酸購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，兔抗人MDR1多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，BH2直立光照照相系統(tǒng)由日本Olympus公司提供，HPIAS-10009增強型病理圖文分析系統(tǒng)購自鄭州太陽電子科技公司。

1.3實驗方法

1.3.1石蠟切片的制作 速眠新(0.5 ml/kg)腹腔注射麻醉小鼠，開胸摘除心臟，從房室交界切開將心臟分為心室和心房2部分。4%多聚甲醛4℃固定48 h，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋，包埋面為房室交界切面。切片時心室修材到可見左右室和室間隔、心房可見心耳和固有心房，切片厚度6 μm，相鄰切片分別貼于蛋白甘油黏附和多聚賴氨酸涂布的載玻片上，貼于蛋白甘油黏附的切片，進行HE染色，光學顯微鏡下觀察形態(tài)。

1.3.2免疫組化染色 貼于多聚賴氨酸的切片脫蠟至水，按試劑盒說明操作。一抗為兔抗人c-Kit多克隆抗體(1∶100)、兔抗人MDR1多克隆抗體(1∶50)或鼠抗人PCNA單克隆抗體(1∶200)。兔抗人c-Kit多克隆抗體和兔抗人MDR1多克隆抗體的二抗為生物素化山羊抗兔工作液，鼠抗人PCNA單克隆抗體為生物素化山羊抗鼠IgG。DAB顯色，蘇木素復染。

1.4圖像分析 采用鄭州太陽電子科技公司的HPIAS-10009增強型病理圖文分析系統(tǒng)進行圖像分析，對每只小鼠心臟的每種免疫組化染色標本的固有心房、心耳、左心室、右心室和室間隔均采集5個高倍(×400)視野，用陽性區(qū)平均灰度值作為c-Kit、MDR1、PCNA表達的量。平均灰度值與表達強度一致。

1.5統(tǒng)計學處理 采用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析和SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1c-Kit在小鼠心臟的表達 c-Kit陽性呈黃色或棕黃色顆粒，主要定位于細胞膜上，心肌細胞居多。c-Kit在小鼠固有心房、心耳、室間隔、左心室和右心室的表達水平有差異，由高到低依次為左心室、心耳、室間隔、固有心房和右心室(P<0.01)。見表1及圖1。

表1 小鼠心臟不同部位c-Kit、MDR1和PCNA的表達±s，n=6)

2.2MDR1在小鼠心臟的表達 MDR1免疫組化陽性信號主要定位于細胞膜上，呈棕黃色顆粒彌漫分布，心肌細胞較多，MDR1在小鼠固有心房、心耳、室間隔、左心室和右心室的表達水平有統(tǒng)計學差異，MDR1表達由高到低依次為心耳、右心室、左心室、固有心房和室間隔(P<0.05)，見表1，圖1。

2.3PCNA在小鼠心臟組織中的表達 PCNA免疫組化陽性信號主要定位于細胞核上，呈棕黃色或深棕色分布，主要存在于心肌細胞間結(jié)締組織的細胞中。固有心房與室間隔、固有心房與左心室、空間隔與左心室、心耳與右心室之間PCNA表達灰度值的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，在固有心房、室間隔和左心室的表達較高，心耳與右心室的表達較低(P<0.05)，見圖1和表1。

c-Kit MDR1 PCNA

3 討 論

c-Kit由跨膜c-Kit原癌基因編碼，同血小板衍生的生長因子和集落刺激因子-1屬于同一受體家族。c-Kit是經(jīng)典的干細胞標記之一，胚胎大鼠〔4〕、新生大鼠〔5〕等心肌分離的具有自我更新能力并能分化成心肌細胞、內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞的細胞均為c-Kit陽性，心梗小鼠心c-Kit陽性細胞可以增生、遷移向缺血區(qū)并分化為心肌和血管〔6〕。在犬的心臟，c-Kit陽性的CSCs分化為心肌細胞的數(shù)量分別是MDR1陽性的2.3倍〔7〕。c-Kit促進CSCs的向心肌分化直至終末分化〔8〕。Ayach等〔9〕發(fā)現(xiàn)c-Kit信號在預防心室擴大和肥大中有重要作用。由血管緊張素Ⅱ受體〔10〕、雌激素α受體〔11〕介導的心臟保護也是通過c-Kit陽性細胞實現(xiàn)的。在大鼠抗高血糖誘發(fā)的心臟的氧化應激過程中，c-Kit陽性細胞參與其中，表現(xiàn)為左心室c-Kit陽性細胞數(shù)量增加和增殖速度加快而心房的c-Kit陽性細胞數(shù)量減少〔12〕。培養(yǎng)早期的CSCs可以表達包括c-Kit和Sca-1等多種表面標記物，隨著細胞的成熟有些表面標記物逐漸消失，但c-Kit不隨細胞生長成熟而消失。

研究顯示c-Kit陽性細胞在人心臟的不同部位有差別，Pouly等〔13〕對心臟移植受體患者的心內(nèi)膜及右心耳的活檢組織用免疫組化的方法觀察發(fā)現(xiàn)心內(nèi)膜的c-Kit陽性細胞明顯比右心耳多(P=0.01)；Itzhaki-Alfia等〔14〕對人心臟或心臟活檢標本用細胞培養(yǎng)和流式細胞儀分選的方法研究發(fā)現(xiàn)c-Kit陽性細胞數(shù)量由高到低依次為右房、左心室、左房及右心室，女性的c-Kit陽性細胞較多。本研究結(jié)果提示心臟各部位c-Kit的表達不同在人和鼠相似，在心臟各部位c-Kit陽性高低的排序在人和鼠的不同可能因素有觀察個體的生理病理狀態(tài)、檢測方法和人和鼠的種屬差異等。

MDR1存在于細胞膜，為能量依賴性的外排泵，Sellers等〔15〕人證實在恒河猴心臟內(nèi)分離出的干細胞表面可表達MDR1陽性，Quaini等〔16〕得出人心臟有可能存在著CSCs的研究結(jié)果顯示具有干細胞表面相關(guān)抗原特征的原始細胞表現(xiàn)為MDR1陽性，Dergilev等〔17〕報道心室壁瘤的瘤壁全層都有c-Kit和MDR1共表達細胞，Beltrami等〔18〕從大鼠心肌內(nèi)分離出的原始細胞c-Kit和MDR1同時陽性并能分化成心肌細胞。盡管在人〔19〕和大鼠心臟的原始細胞均發(fā)現(xiàn)有c-Kit和MDR1共表達現(xiàn)象，但對犬的心臟觀察發(fā)現(xiàn)c-Kit陽性、MDR1陽性或Sca-1陽性的CSCs占5%，60%以上的CSCs表達3種抗原，約8%表達2種抗原〔7〕。本實驗提示c-Kit和MDR1在小鼠心臟各部位的表達和犬相似有不一致性。

研究發(fā)現(xiàn)人未成熟心肌和晚期衰竭心肌PCNA有表達，陳舊性心肌梗死區(qū)的心肌細胞和新生細胞也有PCNA表達〔20〕，擴張型心肌病晚期患者的心肌組織PCNA的表達率與存活時間呈正相關(guān)〔21〕，克氏錐蟲感染性心肌炎的炎性部位PCNA的陽性表達增高〔22〕；大鼠心梗死者的心梗區(qū)組織也有些細胞PCNA陽性〔23〕，這些研究涉及未成熟心肌和心肌損傷修復，幾乎沒有涉及PCNA在正常成年的心肌組織表達。本實驗結(jié)果提示在正常狀態(tài)下，心肌細胞增殖活性很低，但間質(zhì)細胞增殖活性較高；PCNA在固有心房、室間隔和左心室的表達較高，心耳與右心室的表達較低，可能與功能活動有關(guān)。

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