李春花 周 磊

(吉林省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，吉林 長(zhǎng)春 130021)

糖尿病腎病(DN)已經(jīng)超過(guò)高血壓腎病成為我國(guó)終末期腎病的第二位病因〔1〕。目前現(xiàn)有的臨床治療方法難以完全阻斷DN進(jìn)展，因此迫切需要深入研究其機(jī)制以開(kāi)發(fā)新的治療方法。白藜蘆醇是一種從植物中提取的多酚醇類(lèi)物質(zhì)，是沉默信息調(diào)節(jié)子(SIRT)1的天然激活劑?，F(xiàn)有大量研究證明，其對(duì)糖尿病的多種并發(fā)癥具有良好的治療作用，但機(jī)制尚不完全清楚〔2〕。SIRT1作為三級(jí)組蛋白去乙酰化酶，其活性變化可影響線粒體代謝和功能〔3〕。本研究觀察白藜蘆醇干預(yù)后DN大鼠腎組織中線粒體分裂、融合基因轉(zhuǎn)錄水平變化和線粒體膜電勢(shì)變化，探討其對(duì)腎臟的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性Wistar大鼠45只，體重(200±20)g。隨機(jī)分為對(duì)照組、DN組和白藜蘆醇治療組(RSV組)各15只。

1.2試劑與儀器 RNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司，PCR試劑盒購(gòu)自北京天根公司，白藜蘆醇購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，組織線粒體提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，線粒體膜電勢(shì)檢測(cè)試劑盒JC-1購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，全自動(dòng)生化分析儀為日本Olympus公司產(chǎn)品。

1.3建立DN大鼠模型 參考文獻(xiàn)〔4〕進(jìn)行少量修改，建立2型DN大鼠模型。健康Wistar大鼠，高脂飲食，腹腔一次性注射鏈脲佐菌素(STZ)50 mg/kg建立2型糖尿病模型(空腹血糖≥16.7 mmol/L，尿糖++以上)，繼續(xù)喂養(yǎng)12 w，根據(jù)血尿生化學(xué)檢測(cè)、組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)，確立DN大鼠模型建立成功。

1.4給藥方法 對(duì)照組和DN組生理鹽水5 ml·kg-1·d-1灌胃。RSV組白藜蘆醇20 mg·kg-1·d-1灌胃。均連續(xù)給藥12 w，于治療結(jié)束后，收集24 h尿標(biāo)本，腹腔麻醉，取血標(biāo)本和腎組織標(biāo)本。

1.5檢測(cè)指標(biāo) 生化分析法檢測(cè)血糖，酶聯(lián)免疫法測(cè)定24 h尿白蛋白排泄率，肌酐清除率。

1.6線粒體分裂、融合基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)變化 提取大鼠腎組織總RNA，分光光度計(jì)測(cè)定RNA質(zhì)量和濃度。實(shí)時(shí)多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)線粒體融合基因Mfn1、Mfn2和線粒體分裂基因Fis1、Drp1 mRNA表達(dá)變化。引物及PCR反應(yīng)條件見(jiàn)參考文獻(xiàn)〔5〕。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳后，天能凝膠成像系統(tǒng)成像保存。

1.7線粒體膜電勢(shì)檢測(cè) 按照線粒體提取試劑盒說(shuō)明書(shū)，從新鮮腎組織中提取完整線粒體，用線粒體膜電勢(shì)檢測(cè)試劑盒(JC-1)染色線粒體，流式細(xì)胞儀最大激發(fā)波長(zhǎng)為514 nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為529 nm檢測(cè)。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組空腹血糖的比較 對(duì)照組空腹血糖(5.13±0.62)mmol/L，DN組(24.55±2.16)mmol/L,RSV組(21.74±5.34)mmol/L。DN組和RSV組血糖無(wú)明顯差異(P>0.05)。

2.2各組肌酐清除率和24 h尿白蛋白的比較 對(duì)照組肌酐清除率(0.13±0.02)ml·min-1·100 g-1，DN組(0.37±0.07)ml·min-1·100 g-1，RSV組(0.19±0.05)ml·min-1·100 g-1。與DN組相比，RSV組明顯降低(P<0.05)。對(duì)照組24 h尿白蛋白(1.93±0.42)mg/24 h，DN組(15.12±3.47)mg/24 h，RSV組(7.04±2.32)mg/24 h。與DN組相比，RSV組明顯降低(P<0.05)。

2.3各組腎臟組織中線粒體動(dòng)態(tài)變化平衡的影響 與對(duì)照組相比，線粒體融合基因Mfn1、Mfn2和線粒體分裂基因Fis1、Drp1在DN組均有不同程度增高，但其中Mfn2表達(dá)變化不明顯。與DN組相比，RSV組Mfn1、Fis1降低明顯(P<0.05)，而Drp1雖有所降低，但程度變化較小(見(jiàn)表1和圖1)。

表1 3組Mfn1、Mfn2、Fis1、Drp1mRNA表達(dá)的密度掃描(n=3,±s)

圖1 各組Mfn1、Mfn2、Fis1和Drp1的RT-PCR結(jié)果

2.4各組腎臟組織中線粒體膜電勢(shì)的影響 與對(duì)照組(100.0%)相比，DN組、RSV組線粒體膜電勢(shì)均有降低(P<0.05)。與DN組(60.24%±7.11%)相比，RSV組(83.04%±9.17%)明顯增高(P<0.05)。

3 討 論

糖尿病是慢性代謝性疾病，其發(fā)病率在全世界范圍內(nèi)呈持續(xù)增長(zhǎng)勢(shì)頭。糖尿病患者長(zhǎng)期的高血糖狀態(tài)是促進(jìn)血管病變和功能障礙的根本因素，引起多種糖尿病并發(fā)癥，是糖尿病患者主要的致殘致死原因。老年患者是慢性代謝性疾病和心血管疾病的高發(fā)人群。在臨床治療中，血糖穩(wěn)態(tài)控制的困難及腎素-血管緊張素系統(tǒng)抑制劑治療難以完全阻斷腎病進(jìn)展。SIRT1作為代謝相關(guān)疾病治療研究的熱點(diǎn)，其在腎臟活化可能成為新的治療靶點(diǎn)，以抵抗多種因素導(dǎo)致的腎臟疾病包括DN的發(fā)生發(fā)展〔3〕。本文結(jié)果表明白藜蘆醇具有明顯的腎臟保護(hù)作用。

細(xì)胞內(nèi)SIRT1活性受代謝和環(huán)境因素的影響。熱量限制、饑餓、氧化應(yīng)激和DNA損傷等都可誘導(dǎo)SIRT1表達(dá)增加，而高脂飲食、胰島素抵抗、高血糖、老化則引起SIRT1表達(dá)降低。SIRT1去乙?；孜锸羌?xì)胞代謝、能量消耗、炎癥和應(yīng)激反應(yīng)通路的中心調(diào)節(jié)因子〔6〕。如SIRT1可通過(guò)去乙?；?lài)氨酸殘基激活過(guò)氧化物酶體增殖活化受體γ共激活因子(PGC)1α，增高線粒體生物能量合成〔7〕。葡萄糖是維持煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化型/還原型(NAD+/NADH)穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵代謝底物，高血糖會(huì)通過(guò)影響重要代謝途徑降低胞質(zhì)NAD+/NADH比率，從而影響SIRT1活性。綜上所述，高血糖狀態(tài)可影響SIRT1活性和線粒體功能，而SIRT1、線粒體功能均在糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用。

線粒體的動(dòng)態(tài)變化包括線粒體分裂過(guò)程和線粒體融合過(guò)程。線粒體分裂、融合過(guò)程的平衡對(duì)于維持線粒體正常的形態(tài)、分布和功能十分重要〔8〕。本文表明線粒體的動(dòng)態(tài)平衡在DN過(guò)程中發(fā)生變化。白藜蘆醇能明顯提高DN大鼠腎組織線粒體功能。白藜蘆醇可通過(guò)活化SIRT1從而影響線粒體動(dòng)態(tài)平衡和功能發(fā)揮對(duì)DN大鼠腎臟功能的保護(hù)作用。

4 參考文獻(xiàn)

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