陸何林 吳科鋒 呂應(yīng)年 朱建紅 李 立

(廣東醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，廣東 湛江 524023)

阿霉素已被廣泛用于急性白血病、乳腺癌、卵巢癌及肺癌的治療〔1〕。但是，由于會產(chǎn)生劑量依賴的心臟毒性，阿霉素臨床應(yīng)用受到限制〔1〕。造成阿霉素這種毒副作用的機(jī)制雖然尚無定論，但氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡是最可能的原因，這是因?yàn)榘⒚顾乜烧T導(dǎo)心肌細(xì)胞產(chǎn)生活性氧(ROS)/活性氮并觸發(fā)細(xì)胞凋亡信號從而導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡〔2～6〕。因此，許多研究以抑制阿霉素誘導(dǎo)的活性氧(ROS)/活性氮及細(xì)胞凋亡為目的并以此阻止心臟毒性的發(fā)生〔7～11〕。但是，目前還沒有一個(gè)藥物被證明能夠有效、安全地預(yù)防阿霉素的此類毒副作用。還原型谷胱甘肽(GSH)為非酶性抗氧化劑，通過其巰基氧化-還原態(tài)的轉(zhuǎn)換，作為可逆的供氫體，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮抗氧化作用。GSH(泰特)目前已被臨床用于預(yù)防藥物毒性，但關(guān)于其可否作為阿霉素化學(xué)保護(hù)劑的探討還未見報(bào)道，本研究就此初步探討。

1 資料與方法

1.1試劑及儀器 RPMI-1640培養(yǎng)基干粉、MTT(Sigma公司)；新生牛血清(Hyclone公司)；胰蛋白酶(Amresco公司)；注射用阿霉素(海正藥業(yè))；GSH、活性氧檢測試劑盒、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(碧云天)；蛋白提取試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒、GAPDH單克隆抗體、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、PVDF膜(凱基)；p53單克隆抗體(博士德)；辣根過氧化物酶標(biāo)記抗鼠抗體(Santa公司)；YJ-875醫(yī)用凈化工作臺(蘇州凈化設(shè)備公司)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(Precision 公司)；ELx800 酶標(biāo)儀(BIO-TEK 公司)；流式細(xì)胞儀(EPICS XL公司)；垂直電泳儀(Bio-rad公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) A549為非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系，由本實(shí)驗(yàn)室液氮冷凍保存。A549細(xì)胞于含10%新生牛血清的RMPI 1640培養(yǎng)液內(nèi)，在37℃、含5% CO2的飽和濕度空氣中培養(yǎng)。

1.3MTT法檢測癌細(xì)胞存活率 接種A549細(xì)胞于96孔培養(yǎng)板，確定每孔含細(xì)胞2 000個(gè)。細(xì)胞貼壁后換液，并設(shè)下列實(shí)驗(yàn)組：對照組、GSH 100、300、900 μg/ml、阿霉素1.5 μg/ml、GSH 100 μg/ml+阿霉素1.5 μg/ml、GSH 300 μg/ml+阿霉素1.5 μg/ml、GSH 900 μg/ml+阿霉素1.5 μg/ml。實(shí)驗(yàn)組每個(gè)劑量設(shè)8個(gè)平行孔，陰性對照組同樣設(shè)8孔。經(jīng)24、48、72 h培養(yǎng)后，加MTT染液(MTT終濃度為0.5 mg/ml)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加DMSO 100 μl，震蕩5 min后以酶標(biāo)儀檢測波長570 nm處吸光度，計(jì)算腫瘤細(xì)胞存活率。

1.4采用血球計(jì)數(shù)板檢測癌細(xì)胞存活率 由于高濃度GSH可以使MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜(Formazan)造成假陽性，因此當(dāng)按下列方法處理細(xì)胞時(shí)采用血球計(jì)數(shù)板檢測癌細(xì)胞存活率：陰性對照組、GSH 1 000、3 000、9 000 μg/ml、阿霉素1.5 μg/ml、1 000 μg/ml+ 阿霉素1.5 μg/ml、3 000 μg/ml+阿霉素1.5 μg/ml、GSH 9 000 μg/ml+阿霉素1.5 μg/ml。經(jīng)30 h培養(yǎng)后，檢測細(xì)胞存活情況。

1.5流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)ROS、細(xì)胞凋亡 接種細(xì)胞于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞貼壁后按下述方法處理：陰性對照、GSH 9 000 μg/ml、阿霉素1.5 μg/ml、GSH 9 000 μg/ml + 阿霉素1.5 μg/ml。24 h培養(yǎng)后，按試劑盒說明書檢測細(xì)胞內(nèi)ROS生成及細(xì)胞凋亡水平。

1.6Western印跡檢測 接種細(xì)胞于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞貼壁后按下述方法處理：陰性對照、GSH 9 000 μg/ml、阿霉素1.5 μg/ml、GSH 9 000 μg/ml + 阿霉素1.5 μg/ml。24 h培養(yǎng)后收集細(xì)胞，并按照蛋白提取試劑盒所附操作指南提取細(xì)胞蛋白，以蛋白定量試劑盒測定所提蛋白濃度，分裝后冷凍保存。SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉1 h 后加一抗，4℃孵育過夜；洗膜后加二抗，室溫孵育1 h；洗膜、曝光顯影。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS12.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1100、300、900 μg/ml的GSH單獨(dú)或聯(lián)合阿霉素對A549增殖活性的影響 100、300、900 μg/ml的GSH單獨(dú)或聯(lián)合阿霉素處理24 h、48 h及72 h，對A549增殖活性均無顯著性影響(表1)。

表1 各劑量GSH單獨(dú)或聯(lián)合阿霉素處理對A549細(xì)胞活性的影響±s，%，n=8)

2.21 000、3 000、9 000 μg/ml的GSH單獨(dú)或聯(lián)合阿霉素對A549增殖活性的影響 1 000、3 000、9 000 μg/ml的GSH單獨(dú)處理30 h細(xì)胞活性為(74.5±7.6、76.7±6.7、78.6±6.3)，與對照組(100±5.6)相比，可顯著抑制A549的增殖活性(P<0.05)；1 000、3 000、9 000 μg/ml的GSH與阿霉素聯(lián)用30 h(46.8±2.4、49.22±3.2、46.9±1.9)，并不能顯著改變阿霉素(39.2±2.5)對A549細(xì)胞的殺滅效果。

2.39 000 μg/ml的GSH單獨(dú)或聯(lián)合阿霉素對A549內(nèi)ROS生成的影響 阿霉素處理24 h，有ROS生成的A549 細(xì)胞比例(9.7±0.9)與對照組(0.8±0.3)相比顯著升高，而單用9 000 μg/ml GSH(0.6±0.2)及與阿霉素聯(lián)用(5.0±0.6)，可顯著降低有ROS生成的A549細(xì)胞比例。

2.49 000 μg/ml的GSH單獨(dú)或聯(lián)合阿霉素對A549細(xì)胞凋亡的影響 與對照組(82.7± 5.8)%相比阿霉素可顯著降低活的A549細(xì)胞百分比(57.8±7.7)%，即可顯著提高壞死、死亡、晚期凋亡及早期凋亡細(xì)胞的百分比；9 000 μg/ml GSH(65.8±5.7)%與阿霉素聯(lián)用(73.5±6.6)%并不能改變阿霉素所造成的活的A549細(xì)胞百分比的降低。

2.59 000 μg/ml的GSH單獨(dú)或聯(lián)合阿霉素對A549細(xì)胞內(nèi)p53表達(dá)的影響 GSH、阿霉素單獨(dú)或聯(lián)用對p53蛋白表達(dá)均無影響(圖1)。

A.對照組；B.GSH 9 000 μg/ml；C.阿霉素1.5 μg/ml；D.GSH 9 000 μg/ml+阿霉素1.5 μg/ml

3 討 論

一個(gè)理想的阿霉素化學(xué)保護(hù)劑，除了可以減少心臟毒性等毒副作用外，還需不影響阿霉素的抗癌作用。在本研究中，包括極高濃度在內(nèi)的各濃度的GSH與阿霉素聯(lián)用，均不影響阿霉素對肺癌細(xì)胞的殺滅效果。3個(gè)極高濃度的GSH單獨(dú)處理均可顯著抑制肺癌細(xì)胞的增殖活性。ROS過度生成被發(fā)現(xiàn)在幾乎所有癌細(xì)胞內(nèi)，并通過調(diào)控與增殖有關(guān)的相關(guān)基因促進(jìn)癌細(xì)胞的存活〔12，13〕。因此存在這種可能，GSH通過降低癌細(xì)胞內(nèi)ROS水平，間接地抑制了促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、存活的基因的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)了其抑制癌細(xì)胞增殖活性的效果。

本研究提示GSH具有較佳的抗氧化作用。為了進(jìn)一步探討GSH與阿霉素聯(lián)用可能對肺癌細(xì)胞的影響，本研究采用流式細(xì)胞術(shù)分析了極高濃度GSH對A549細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果表明，GSH與阿霉素聯(lián)用與阿霉素單獨(dú)處理相比較，活的肺癌細(xì)胞百分率并沒有顯著差異，從而從另一個(gè)角度證明了GSH不影響阿霉素對肺癌細(xì)胞的殺滅效果。此外，有研究表明，阿霉素可活化肺癌細(xì)胞p53蛋白〔14〕，但是在本研究中，GSH、阿霉素單獨(dú)或聯(lián)用對p53蛋白表達(dá)均無顯著影響。

本研究結(jié)果表明阿霉素對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性幾乎與其誘導(dǎo)的ROS生成無關(guān)，該毒性應(yīng)該主要是通過嵌入迅速增殖的腫瘤細(xì)胞堿基對并阻止DNA復(fù)制而實(shí)現(xiàn)的〔8〕。

綜上所述，GSH具有較佳的抗氧化作用，GSH即使在極高濃度的情況下也不影響阿霉素對體外肺癌細(xì)胞的殺滅效果，提示GSH作為阿霉素化學(xué)保護(hù)劑的潛在可能性。進(jìn)一步的研究還需在體內(nèi)驗(yàn)證上述結(jié)果，并檢測GSH對外心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。

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