張淑紅 王茉琳 戚家峰 劉 爽 楊欣艷 張 虎

(佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154007)

肺癌是發(fā)病與多種因素如吸煙、遺傳、癌基因的激活及抑癌基因的失活等相關(guān)，關(guān)于肺癌的病因?qū)W、預(yù)防、診斷、治療等研究已經(jīng)成為研究領(lǐng)域的重要課題〔1〕。已有研究表明遺傳因素在肺癌的發(fā)生、發(fā)展、治療反應(yīng)、預(yù)后等環(huán)節(jié)中具有重要的作用，因此開展肺癌的遺傳研究對于肺癌易感人群的篩查、治療方法的選擇、預(yù)后判斷等都具有重要的意義。單核苷酸多態(tài)性(SNP)應(yīng)用于肺癌的關(guān)聯(lián)研究，是肺癌研究領(lǐng)域中較為活躍的內(nèi)容之一〔2〕。已有文獻表明，肺癌易感性與某些SNP位點有相關(guān)性〔3〕。DNA甲基化是由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)介導(dǎo)的，DNMT3A與DNMT3B 的功能是產(chǎn)生新的甲基化型。在腫瘤中，啟動子CpG島高甲基化是最常見的表觀遺傳學(xué)改變，在人類各種腫瘤中都有發(fā)現(xiàn)，并和異常的基因轉(zhuǎn)錄沉默相關(guān)〔4〕。SNP、DNA甲基化與腫瘤三者之間的關(guān)系就已經(jīng)有相關(guān)報道〔5〕。本研究旨在探討DNMT3B基因啟動子區(qū)SNP-579G/T位點與肺癌發(fā)病易感性之間的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1材料 病例組選自佳木斯大學(xué)第一附屬醫(yī)院、佳木斯市腫瘤醫(yī)院的肺癌血液樣本98例，男68例，女30例，年齡53～70(平均61.0)歲病例的臨床資料完整。血液標本采集前均沒有抗腫瘤藥物的使用記錄。對照組為健康人血液樣本105例，男60例，女45例，年齡55.0～64.0(平均69.5)歲。其中性別、年齡等與病例組相匹配，見表1。兩組人群都是佳木斯地區(qū)漢族人群，個體之間均無血緣關(guān)系(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1全基因組DNA抽提 采集靜脈全血2 ml，運用DNA提取試劑盒提取基因組DNA，分別提取肺癌患者、健康對照組外周血，提取的DNA溶解于pH8.0 的TE中，4 ℃保存。

1.2.2PCR 引物序列如下：上游5′CAGGTCTCATTATGCCTAGG-3′(nt 1533753-1533772)，下游5′GGGAGCTCACCTTCTAGAAA-3′(1533977-1533958)，擴增產(chǎn)物225 bp。單管反應(yīng)體系25 μl包含dNTPs 0.1 mmol/L，上下游引物各10 pmol，Taq DNA聚合酶1.25 U，DNA 1.0 μl(100 ng)。95 ℃預(yù)變性5 min；95℃ 20 s，56℃20 s，72℃20 s共30個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，溴乙啶染色，紫外燈下觀察。

1.2.3限制性內(nèi)切酶pvuⅡ酶切反應(yīng) 20 μl酶切反應(yīng)體系含10×緩沖液2.0 μl，pvuⅡ(TaKaRa公司)4 U，PCR產(chǎn)物2.0 μl，混勻后37℃水浴中酶切過夜。酶切產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳分析基因型。選擇凝膠電泳證實為 GT基因型，經(jīng)雙脫氧終止法測序。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件進行χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1DNA電泳 采集研究對象EDTA抗凝的外周血，運用基因組提取試劑盒提取全基因組DNA，部分結(jié)果如圖1所示。

2.2PCR-RFLP分析DNMT3B基因啟動子區(qū)SNP位點(-579G/T) PCR產(chǎn)物225 bp，Marker為puc19，其片段大小由上至下依次為：501、403、331、242、190、147、110 bp。如圖2所示。經(jīng)限制性內(nèi)切酶pvuⅡ酶切，酶切產(chǎn)物為132 bp和93 bp，部分結(jié)果如圖3所示。-579G/T位點PCR-RFLP分型結(jié)果經(jīng)測序驗證，利用BLAST與基因DNMT3B全序列(GeneID：1789 NC000020.9)進行比對，如圖4，圖5。

2.3-579G/T位點基因頻率分布 -579G/T位點在肺癌病例組和正常對照組中基因型分布無顯著差異(P>0.05)，見表1，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)驗證兩個群體均為遺傳平衡群體。-579G/T位點與肺癌發(fā)病風險估計無統(tǒng)計學(xué)意義〔P=0.991 3，OR(95%CI)=1.003 6(0.521 6～1.931 0)〕。

圖1 部分模版DNA提取電泳圖

1～3:PCR產(chǎn)物

表1 DNMT3B(-579G/T)基因型和基因頻率分布〔n(%)〕

3、5、7：雜合子GT，其余泳道為純合子TT

圖4 GT雜合子測序圖

圖5 TT純合子測序圖

3 討 論

SNP是指DNA多態(tài)性在人群中的分布頻率大于1%的可遺傳性的變異。研究表明，位于基因啟動子區(qū)的SNP能影響基因的表達或酶的活性〔6〕。本研究所得DNMT3B基因啟動子區(qū)多態(tài)性位點-579G/T該位點與佳木斯地區(qū)肺癌的易感性無顯著相關(guān)性，且兩組中均為檢出GG基因型個體。

DNMT3B基因的SNP位點與疾病的關(guān)聯(lián)研究已見報道，目前集中在某單個的位點及某些單體型的研究，且各個位點在人群中基因型的分布及SNP位點與疾病的相關(guān)性具有民族性、區(qū)域性的差異。文獻報道表明DNMT3B啟動子區(qū) C46359T的CT+TT基因型所患肺癌的風險幾乎是CC基因型的2倍〔7〕；Hu等〔8〕采用PCR-RFLP 和DNA 測序的方法，對259例胃癌患者和262位健康對照人群的DNMT3B啟動子區(qū)SNP-149C/T 和-579G/ T位點進行分析，結(jié)果表明，-579G/ T 位點與胃癌易感性相關(guān)，攜帶G 等位基因的個體較TT 基因型個體患胃癌的易感性低，且該位點基因型在中國人、韓國人和美國人中的分布不同。由此可說明，基因多態(tài)性因人群、種族以及地域分布的不同而存在差異，進而導(dǎo)致不同人群對腫瘤易感性的差異。Srivastava等〔9〕研究表明DNMT3B啟動子-579G/ T位點與印度北部地區(qū)膽囊癌的易感性無顯著相關(guān)性。

與肺癌發(fā)病相關(guān)的多態(tài)性位點已有文獻報道，例如Wang等〔10〕首次研究了CYP2A13常見多態(tài)性位點rs8192789(Arg257Cys)與中國漢族人群的肺癌易感性，研究發(fā)現(xiàn)該位點與肺腺癌具有相關(guān)性，CT+TT基因型較CC基因型降低了腺癌的易感性。之后法國的研究者〔11〕研究了高加索人群另一個多態(tài)性位點(Arg101Stop)與肺癌易感性的關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn)該位點與小細胞肺癌具有相關(guān)性。D'Agostino等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)多態(tài)性位點CT或TT基因型(Arg257Cys)的CYP2A13明顯降低了對煙草前致癌物的代謝，與Wang的研究結(jié)果是一致的。Zhang等〔13〕研究了p53常見多態(tài)性位點rs1042522、Arg72Pro與肺癌易感性的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在高加索人群中攜帶Pro72Pro基因型的個體的肺癌的易感性增加。Mechanic等〔14〕從單體型水平上研究了高加索人群和非洲人群中p53基因多態(tài)性與肺癌易感性的關(guān)系，他在對p53基因進行整體分析的基礎(chǔ)上選擇了16個常見SNP，包括標簽SNP(tagger SNP)和功能性SNP，結(jié)果發(fā)現(xiàn)rs1042522、rs9895829、rs2909430、rs1625895、rs12951053在非洲人群中與肺癌易感性以及預(yù)后有關(guān)聯(lián)，而由rs1042522、rs9895829、rs2909430、rs1625895組成的一個單體型OR值達到2倍以上。Sauter等〔15〕的研究也發(fā)現(xiàn)了在高加索人群中MMP1的常見多態(tài)性與肺癌的發(fā)生具有相關(guān)性。本實驗室在前期的研究中表明，DNMT3B基因啟動子區(qū)多態(tài)性位點-149C/T與本地區(qū)肺癌的發(fā)生無相關(guān)性〔16〕。

總之，關(guān)于SNP與肺癌易感性的研究已經(jīng)成為肺癌遺傳學(xué)研究領(lǐng)域中的一個熱點，大量的研究發(fā)現(xiàn)了可能與肺癌發(fā)生具有關(guān)聯(lián)的易感性SNP，這些有關(guān)聯(lián)的SNP理論上有望成為篩選肺癌易感人群的分子標志物。從基因多態(tài)性與肺癌易感性關(guān)系著手研究，可以從基因的水平解讀種族間肺癌易感性的差別，為易感者的篩選，肺癌早期診斷提供遺傳標記。研究這種不同個體間基因的差異對于肺癌的臨床個體化治療的實施具有重要意義。本實驗室在研究DNMT3B基因啟動子區(qū)-149C/T位點的基礎(chǔ)上繼續(xù)研究-579G/T位點，也是對DNMT3B基因的SNP-579G/T多態(tài)性在佳木斯地區(qū)基因型分布及其與肺癌發(fā)生關(guān)系的初步探索，由于樣本量不大，再加上有些基因型在人群中的分布比例較小，所以不能完全確定DNMT3B基因-579G/T多態(tài)性與肺癌易感性無關(guān)?？稍诖藢嶒灮A(chǔ)上繼續(xù)加大樣本進行按吸煙、病情分期、分層來探討兩者間的關(guān)系，同時需要做SNP單體型的研究。至于該基因的SNP位點與其他腫瘤易感性的關(guān)系，尚需進行更深入的研究，加以闡明。

SNP將幫助人們認識復(fù)雜的多基因疾病，如癌癥、糖尿病、血管性疾病和某些精神性疾病〔17〕，影響這些疾病的基因很難用傳統(tǒng)方法確定。而SNP和藥物或疾病的易感性相關(guān)，使其能在攻克癌癥方面有所作為，這對腫瘤藥物的開發(fā)和分子靶向治療都有很大的促進作用。隨著對表觀遺傳與遺傳變異研究的不斷深入，SNP將為腫瘤易感性預(yù)測、預(yù)防及治療帶來新啟示。

4 參考文獻

1Jemal A，Siegel R，Ward E，etal.Cancer statistics〔J〕.CA Cancer J Clin，2009;59(4)：225-49.

2滑 峰，周清華.肺癌相關(guān)單核苷酸多態(tài)性的研究進展〔J〕.中國肺癌雜志，2011;14(2)：156-8.

3Lee SJ，Jeon HS，Jang JS，etal.DNMT3B polymorphisms and risk of primary lung cancer〔J〕.Carcinogenesis，2005;2(26)：403-9.

4林 昀，黃 健，韓澤廣.表遺傳學(xué)與腫瘤〔J〕.國際遺傳學(xué)雜志，2006；29(3)：191-3.

5蔣逸群，胡多沙，段 芝，等.DNA甲基化、單核苷酸多態(tài)性與腫瘤〔J〕.國際病理科學(xué)與臨床雜志，2011；31(6)：499-502.

6Shen H，Wang L，Spitzm R，etal.A novel polymorphism in human cytosine DNA2methyltransferase3B promoter is associated with an increased risk of lung cancer〔J〕.Cancer Res，2002；62(17)：4992-5.

7Lee SJ，Jeon HS，Jang JS，etal.DNMT3B polymorphisms and risk of p rimary lung cancer〔J〕.Carcinogenesis，2005；26(2)：403-9.

8Hu J，F(xiàn)an H，Liu D，etal.DNMT3B promoter polymorphism and risk of gastric cancer〔J〕.Dig Dis Sci，2009；55(4)：1011-6.

9Srivastava K，Srivastava A，Mittal B.DNMT3B-579 G>T promoter polymorphism and risk of gallbladder carcinoma in North Indian population〔J〕.J Gastrointest Cancer，2010；41(4)：248-53.

10Wang H，Tan W，Hao B，etal.Substantial reduction in risk of lung adenocarcinoma associated with genetic polymorphism in CYP2A13，the most active cytochrome P450 for the metabolic activation of tobacco-specific carcinogen NNK〔J〕.Cancer Res，2003；63(22)：8057-61.

11Cauffiez C，Lo-Guidice JM，Quaranta S，etal.Genetic polymorphism of the human cytochrome CYP2A13 in a French population：implication in lung cancer susceptibility〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2004；317(2)：662-9.

12D′Agostino J，Zhang X，Wu H，etal.Characterization of CYP2A13*2，a variant cytochrome P450 allele previously found to be associated with decreased incidences of lung adenocarcinoma in smokers〔J〕.Drug Metab Dispos，2008；36(11)：2316-23.

13Zhang X，Miao X，Guo Y，etal.Genetic polymorphisms in cell cycle regulatory genes MDM2 and TP53 are associated with susceptibility to lung cancer〔J〕.Hum Mutat，2006;27(1)：110-7.

14Mechanic LE，Bowman ED，Welsh JA，etal.Common genetic variation in TP53 is associated with lung cancer risk and prognosis in African Americans and somatic mutations in lung tumors〔J〕.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2007;16(2)：214-22.

15Sauter W，Rosenberger A，Beckmann L，etal.Matrix metalloproteinase 1(MMP1)is associated with early-onset lung cancer〔J〕.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2008;17(5)：1127-35.

16張淑紅，楊琳紅，馬雪梅，等.DNMT3B基因SNP(-149C/T)與佳木斯地區(qū)肺癌發(fā)病風險的關(guān)系〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2011;31(21)：4090-1.

17楊永強，王巍杰，徐長波.單核苷酸多態(tài)性研究進展〔J〕.化學(xué)與生物工程，2009;26(8)：19-21.