吳國武 廖志東 黎佳全

大腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，局部浸潤、侵襲及淋巴道轉移是影響大腸癌患者預后的重要因素。Maspin基因是絲氨酸蛋白酶抑制劑(serpin)超家族的成員之一，Maspin 蛋白能抑制腫瘤生長和轉移，可作為腫瘤轉移及預后評估的重要指標。而血管內(nèi)皮生長因子C(vascular endothelial growth factors C，VEGF-C)作為特異性的淋巴管生長因子，與腫瘤的淋巴轉移相關。目前有關大腸癌中Maspin蛋白的表達的研究尚不多，而大腸癌中Maspin與VEGF-C的關系，鮮見文獻報道。本研究采用免疫組化法檢測大腸癌組織中Maspin、VEGF-C的表達情況，探討其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用及兩者之間的關系。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集2006年8月-2009年4月間在我院行根治性手術切除的大腸癌標本蠟塊97例，每例大腸癌標本均留取相對應的癌旁正常大腸組織。所有病例均為初治患者，術前未進行放化療，臨床病理資料完整。97例中男性52例，女性45例；年齡37～69歲，中位年齡53歲。臨床分期按Duke's分期：A、B期50例，C、D期47例。有淋巴結轉移40例，無轉移57例。病理類型均為腺癌。腫瘤分化程度：高分化54例，中低分化43例。以97例大腸癌標本為實驗組，每例標本所對應的癌旁正常組織為對照組。

1.2 免疫組化染色

所有蠟塊均行4 μm厚切片，Maspin蛋白檢測采用Maxvision 免疫組化法，VEGF-C蛋白檢測采用S-P法。濃縮型小鼠抗人Maspin單克隆抗體(EWA 24)、兔抗人VEGF-C多克隆抗體及通用型SP試劑盒、Maxvision試劑盒均購自福州邁新生物技術有限公司。方法按試劑盒說明要求進行，石蠟切片用高溫高壓法修復抗原，染色過程中均用試劑公司提供的陽性切片作陽性對照，用PBS 替代一抗作陰性對照，DAB 顯色，蘇木精復染。

1.3 結果判定

VEGF-C及Maspin蛋白均以腫瘤細胞質和(或) 核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞，由2位病理醫(yī)生在雙盲狀態(tài)下對免疫組化染色結果進行評價，每張切片隨機觀察5個高倍視野，每個視野計數(shù)100個細胞，VEGF-C和Maspin的表達分別參照文獻[1-2]進行陽性判斷。

1.4 統(tǒng)計學處理

應用SPSS13.0對數(shù)據(jù)資料進行處理，計數(shù)資料用χ2檢驗，Maspin和VEGF-C的相關性分析采用Spearman相關系數(shù)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Maspin、VEGF-C表達與臨床病理特征的關系

Maspin蛋白在癌旁正常組織及癌組織中的陽性表達率分別為77.31%(75/97)、58.76%(57/97)，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.006，χ2=7.68)。癌組織中Maspin表達與腫瘤大小、浸潤深度、Duke's分期有關，而與性別、年齡、淋巴結狀態(tài)、組織學分化程度無關，見表1。

VEGF-C蛋白在癌旁正常組織及癌組織中的陽性表達率分別為29.90%(29/97)、63.92%(62/97)，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000，χ2=22.54)。癌組織中VEGF-C表達與腫瘤浸潤深度、淋巴結狀態(tài)、Duke's分期有關，而與性別、年齡、組織學分化程度及腫瘤大小無關，見表1。

2.2 VEGF-C與Maspin表達的相關性

本組57例Maspin表達陽性的病例中有31例VEGF-C同時表達陽性，40例Maspin表達陰性的病例中，VEGF-C表達亦陰性者9例，雙向有序列聯(lián)卡方分析顯示Maspin和VEGF-C的表達呈負相關(Spearman 相關系數(shù)γ=-0.310，P=0.002)，見表2。

表1 大腸癌中Maspin、VEGF-C表達與各臨床病理因素的關系/例

表2 大腸癌中Maspin與VEGF-C表達的相關性/例

3 討論

1994年Zou等[3]從人正常乳腺細胞中分離出1個基因，由于其編碼的蛋白是絲氨酸蛋白酶抑制劑(serin protease inhibitor,Serpin)超家族的成員，故又稱作Maspin 基因(mammary serpin)。Maspin在乳腺、前列腺、卵巢、胃腸道等正常器官組織中呈高水平表達，而在相應惡性腫瘤進展過程中多表現(xiàn)為表達下調(diào)或不表達，提示Maspin可以作為腫瘤轉移及預后評估的1個重要指標。大量研究表明，Maspin主要通過誘導細胞凋亡、降低腫瘤細胞的運動和侵襲能力、抑制新生血管形成以及增加細胞間黏附性等途徑對腫瘤發(fā)揮抑制作用。

Maass等[4]對正常乳腺腺體、乳腺纖維囊性變、原位導管癌、浸潤性癌進行免疫組化檢測時發(fā)現(xiàn)，Maspin基因在正常乳腺良性病變中呈高表達，而在原位導管癌→侵襲性乳腺癌→淋巴結轉移癌3個不同階段，Maspin基因的表達呈明顯下降趨勢，提示Maspin基因的表達對乳腺腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉移的形成有影響。鄒紀東等[5]報道，下咽癌中Maspin蛋白的表達率僅為47.2%，顯著低于喉良性病變的83.3%和喉癌前病變的70%，且與患者的淋巴結轉移和預后相關。黃秋實等[2]對結腸癌的研究發(fā)現(xiàn)，Maspin的表達明顯低于正常腸黏膜及腺瘤，且Maspin表達與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移和Duke's分期相關。本研究結果與之類似，只有淋巴結陽性組的Maspin表達率明顯低于淋巴結陰性組，但尚未達到統(tǒng)計學意義水平(P=0.059)，可能與樣本量不夠有一定關系。

VEGF-C是Joukov等[6]從人類前列腺癌細胞株PC-3的cDNA文庫中克隆并分離出VEGF/PDGF家族的1個新成員。作為第1個被發(fā)現(xiàn)的特異性淋巴管內(nèi)皮生長因子，VEGF-C通過與淋巴管內(nèi)皮細胞表面的特異性抗體VEGFR-3結合，介導和啟動受體的酪氨酸激酶信號系統(tǒng)，促進毛細淋巴管內(nèi)皮細胞的分裂增殖、毛細淋巴管的擴張和數(shù)量增加，在腫瘤的淋巴管生成及淋巴結轉移過程中具有關鍵性作用。

Maeda等[7]對221例T1期結、直腸癌標本的研究顯示，VEGF-C陽性組淋巴結轉移率較陰性組高，多因素分析則更顯示VEGF-C是淋巴結轉移的獨立影響因素。帖曉靜等[8]用原位雜交技術檢測大腸癌組織中VEGF-C的mRNA表達，發(fā)現(xiàn)癌組織中VEGF-C 的 mRNA陽性表達率與Duke's分期、浸潤深度和淋巴結轉移密切相關(P<0.05)，且VEGF-C表達陽性者的淋巴管密度顯著高于VEGF-C表達陰性者。劉濤等[1]則檢測了82例中低位直腸癌的VEGF-C表達情況，結果與我們的研究基本一致，說明VEGF-C的高表達可促進腫瘤淋巴管生成，且與腫瘤的發(fā)展、區(qū)域淋巴結轉移以及預后密切相關。

VEGF-C作為最重要的淋巴管生成因子，其與Maspin的關系目前文獻報道不多，Zhang等[9]最近報道，通過慢病毒載體介導的RNA干擾技術敲除膀胱癌T24細胞的VEGF-C表達，再進行雙向差異凝膠電泳法(2D-DIGE)蛋白質組學分析，發(fā)現(xiàn)Maspin的表達顯著上調(diào)。鄒紀東等[5]的研究也證實，Maspin陽性的下咽癌淋巴管密度(LVD)明顯低于陰性組，呈明顯負相關性，并認為Maspin可能是通過抑制淋巴管生成抑制腫瘤淋巴結轉移。有關胃癌[10]的研究也發(fā)現(xiàn)在蛋白質水平的表達上，VEGF-C與Maspin呈負相關，和我們的結果一致。

綜上，我們認為大腸癌中存在著VEGF-C過度表達及Maspin表達下調(diào)或缺失的情況，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及生物學行為密切相關，且Maspin與VEGF-C的表達呈負相關，兩者有可能作為大腸癌的發(fā)生、發(fā)展及預后的判斷指標。

[1] 劉 濤，張 超，呂 偉，等.VEGF-C在直腸癌中的表達與臨床病理特征的關系〔J〕.中華普通外科雜志2010，25(4)：306-308.

[2] 黃秋實，史成章，王紅建，等.Maspin蛋白及uPA在結腸癌組織中的表達及其臨床意義〔J〕.實用腫瘤學雜志 2008，22(3)：220-223.

[3] Zou Z,Anisowicz A,Hendrix MJ,et al.Maspin,a serpin with tumor-suppressing activity in human mammary epithelial cells〔J〕.Science,1994,263(5146):526-529.

[4] Maass N,Teffner M,Rosel F,et al.Decline in the expression of the serine proteinase inhibitor maspin is associated with tumour progression in ductal carcinomas of the breast〔J〕.J Pathol,2001,195(3):321-326.

[5] 鄒紀東，徐 偉，呂正華，等.下咽癌中maspin表達與血管和淋巴管生成的相關性〔J〕.山東大學學報 (醫(yī)學版)，2010，48(12)：82-85.

[6] Joukov V,Pajusola K,Kaipainen A,et al.A novel vascular endothelial growth factor,VEGF-C,is a ligand for the Flt4 (VEGFR-3) and KDR (VEGFR-2) receptor tyrosine kinases〔J〕.EMBO J，1996,15(2):290-298.

[7] Maeda K,Yashiim M,Nishihara T.Correlation between Va-scular endothelial growth factor-C expression and lymph node metastasis in T1 carcinom of the colon and rectum〔J〕.Surg Today,2003,33:736-739.

[8] 帖曉靜，史成章，王麗玲，等.血管內(nèi)皮生長因子-C與CCR7在大腸癌中的表達〔J〕.實用癌癥雜志，2008，23(1)：44-46.

[9] Zhang HH,Qi F,Zu XB,et al.A proteomic study of potential VEGF-C-associated proteins in bladder cancer T24 cells〔J〕.Med Sci Monit，2012,18(11):BR441-9.

[10] 白玉賢，易繼林，劉勝霞.Maspin蛋白與血管內(nèi)皮生長因子-C在胃癌組織中的表達及其意義〔J〕.實用腫瘤學雜志，2007，21(6)：522-524.