金 丹 吳明勇 劉建剛 袁淑芬 陳曉品

肺癌是我國(guó)目前發(fā)病率較高的癌癥之一，根據(jù)相關(guān)調(diào)查，男性的發(fā)病率高于女性，肺癌已經(jīng)成為男性發(fā)病和死亡率最高的癌癥。最近幾年，肺癌的臨床治療的研究目標(biāo)集中在基因水平上的靶向治療。根據(jù)研究[1]，TRPC1是第一個(gè)哺乳動(dòng)物電位受體蛋白，屬于非選擇性陽(yáng)離子蛋白通道，對(duì)癌癥細(xì)胞的增殖和侵襲等多種癌癥細(xì)胞的惡性行為產(chǎn)生一定的影響。我院針對(duì)SiRNA沉默TRPC1基因?qū)Ψ蜗侔〢549細(xì)胞增殖和侵襲的影響效果展開(kāi)實(shí)驗(yàn)研究，取得的效果比較滿意，現(xiàn)在將研究結(jié)果總結(jié)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 臨床材料

主要材料：實(shí)驗(yàn)室保存的在37℃下、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中、RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)的肺腺癌A549細(xì)胞，美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)的MTT，美國(guó)Abcam公司生產(chǎn)的抗人TRPC1的一抗，美國(guó)Gibco公司生產(chǎn)的RPMI-1640培養(yǎng)基，孔徑為8.0 μm的小室，Cy3標(biāo)記物，美國(guó)Invitrogen公司生產(chǎn)的LipofectamineTM2000。

1.2 方法

TRPC1-SiRNA轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞：將A549細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞密度為每個(gè)孔2×105。第二天用血清培養(yǎng)液稀釋TRPC1-SiRNA(已經(jīng)進(jìn)行Cy3標(biāo)記物標(biāo)記)250 μl，濃度分別稀釋到20、30、50以及100 mmol/L，然后與5 μl的LipofectamineTM2000室溫下孵育5 min后輕輕混合再孵育20 min,然后加入到6孔板接種的A549細(xì)胞的每個(gè)孔，在37℃下、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中6 h后換血清培養(yǎng)液分別培養(yǎng)24 h、48 h以及72 h。然后進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。并計(jì)算轉(zhuǎn)染速率。

A549細(xì)胞的增殖檢測(cè)：將等量的100 mmol/L TRPC1-SiRNA轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞、未轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞以及轉(zhuǎn)染試劑接種于8塊96孔的培養(yǎng)液中，密度是2×103，在5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每孔加入20 μl的MTT培養(yǎng)液，4 h后吸取培養(yǎng)液的上清液，加入150 μl DMSO，應(yīng)用酶聯(lián)免疫標(biāo)記分析儀測(cè)定光密度值，計(jì)算增殖時(shí)間。

A549細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：先按照實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)制備細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)需要的小室膜。將未轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞、TRPC1-SiRNA轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞以及轉(zhuǎn)染試劑400 μl加入上室，等量的培養(yǎng)液加入下室。4%多聚甲醛固定15 min，然后進(jìn)行染色、水洗和風(fēng)干。制片封片后在顯微鏡下觀察并計(jì)算每個(gè)孔平均穿膜數(shù)。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察TRPC1-SiRNA轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞在不同濃度、不同時(shí)間下的轉(zhuǎn)染速率，觀察未轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞、TRPC1-SiRNA轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞以及轉(zhuǎn)染試劑的增殖時(shí)間和穿膜細(xì)胞數(shù)。分析TRPC1-SiRNA對(duì)肺腺癌的治療作用。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組間計(jì)量資料采取F檢驗(yàn)，以P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度和時(shí)間下TRPC1-SiRNA轉(zhuǎn)染速率情況

100 mmol/L TRPC1-SiRNA(Cy3標(biāo)記物標(biāo)記后)轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞48 h速率，明顯大于其他濃度時(shí)的速率。TRPC1-SiRNA(Cy3標(biāo)記物標(biāo)記后)轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞48 h和100 mmol/L濃度下轉(zhuǎn)染速率最大，兩個(gè)對(duì)照組的轉(zhuǎn)染時(shí)間和濃度也設(shè)定為48 h和100 mmol/L濃度，見(jiàn)表1。

表1 不同濃度TRPC1-SiRNA轉(zhuǎn)染不同時(shí)間的轉(zhuǎn)染速率結(jié)果

注：#為轉(zhuǎn)染48 h，與其他濃度TRPC1-SiRNA轉(zhuǎn)染速率相比，P<0.05；100 mmol/L TRPC1-SiRNA濃度下，與其他時(shí)間的轉(zhuǎn)染速率相比，# 為P<0.05。

2.2 MTT法檢測(cè)A549細(xì)胞的增殖時(shí)間

TRPC1-SiRNA基因轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞增殖時(shí)間明顯短于未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 MTT法檢測(cè)A549細(xì)胞的增殖時(shí)間結(jié)果

注：#為與未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染試劑組比較，P<0.05。

2.3 肺腺癌細(xì)胞侵襲能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果

TRPC1-SiRNA基因轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中穿膜細(xì)胞數(shù)明顯少于未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 肺腺癌細(xì)胞侵襲能力實(shí)驗(yàn)中穿膜細(xì)胞數(shù)結(jié)果

注：#為與未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染試劑組比較，P<0.05。

3 討論

肺腺癌是肺癌的1種，主要致病因素是支氣管上皮細(xì)胞癌變，少數(shù)是支氣管的粘液腺發(fā)生癌變。絕大多數(shù)較小的支氣管細(xì)胞癌變的肺腺癌屬于周?chē)头伟７蜗侔┌l(fā)病早期顯的臨床癥狀表現(xiàn)不明顯，患者不易察覺(jué)，胸部 X 線檢查時(shí)肺腺癌可以被發(fā)現(xiàn)。肺腺癌腫瘤形狀為圓形或橢圓形，據(jù)觀察生長(zhǎng)速度比較緩慢，一般血行轉(zhuǎn)移發(fā)生在癌癥早期，淋巴轉(zhuǎn)移發(fā)生在肺腺癌晚期[2-3]。

TRPC1是位于細(xì)胞膜上的一類(lèi)重要的非選擇性陽(yáng)離子通道家族之一。曾有研究報(bào)道過(guò)鈣離子與腫瘤關(guān)系密切，能夠參與到腫瘤的增殖和侵襲等惡性生物學(xué)行為中[4]。非選擇性陽(yáng)離子通道TRPC1作為調(diào)控細(xì)胞鈣離子通道的物質(zhì)，以前部分學(xué)者認(rèn)為該物質(zhì)參與到受體介導(dǎo)的、鈣依賴(lài)的平滑肌以及腺體的分泌和收縮功能。最近有國(guó)外研究證明[5-7]，TRPC1與腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲行為等有關(guān)。SiRNA是通過(guò)RNA干擾技術(shù)在體內(nèi)或者體外培養(yǎng)產(chǎn)生的，會(huì)抑制同源性基因的表達(dá)，使同源細(xì)胞沉默，所以稱(chēng)之為沉默基因。曹新梅等[8]研究證實(shí)SiRNA可以抑制某些癌基因的表達(dá)，從而抑制肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲等惡性生物行為。本院的研究結(jié)果證明，SiRNA沉默TRPC1基因可抑制A549細(xì)胞的增殖能力，降低A549細(xì)胞的侵襲能力，本院這一研究結(jié)論恰好結(jié)合了國(guó)內(nèi)外對(duì)于SiRNA和TRPC1的研究結(jié)論。黃棟等人曾經(jīng)針對(duì)SiRNA沉默B7-H4基因轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染速率、癌細(xì)胞增殖、侵襲以及轉(zhuǎn)移能力的研究，部分結(jié)論與本院的SiRNA沉默TRPC1基因相似[9-10]。結(jié)合國(guó)內(nèi)外多位醫(yī)學(xué)專(zhuān)家學(xué)者針對(duì)SiRNA各個(gè)亞型沉默基因的研究結(jié)論證實(shí)確實(shí)對(duì)癌細(xì)胞的惡性生物性行為有密切關(guān)系，可以應(yīng)用到癌癥的臨床治療中。

[1] 張 駿，朱 震，李雄偉，等.SiRNA沉默TRPC1基因?qū)Ψ蜗侔〢549細(xì)胞增殖和侵襲的影響〔J〕.中華醫(yī)學(xué)雜志，2013，93(28)：2241-2243.

[2] 韓瑞超，范志文，周 敏，等.低氧條件下RNA干擾阻斷Notch3通路對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞增殖的影響〔J〕.上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，33(4)：421-424.

[3] 丁雨欽，曲 杰，張晶晶，等.鴉膽子油乳聯(lián)合siRNA-ERCC1對(duì)肺腺癌A549/DDP細(xì)胞的耐藥逆轉(zhuǎn)作用〔J〕.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18(20)：235-239.

[4] Collins BJ，Kleeberger W，Ball DW.Notch in lung development and lung cancer〔J〕.Semin Cancer Biol，2004，14(5)：357-364.

[5] 滕 穎，王秀問(wèn)，王亞偉，等.小干擾RNA干擾β連環(huán)素表達(dá)對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞Wnt信號(hào)通路的作用〔J〕.中華醫(yī)學(xué)雜志，2010，90(14)：988-992.

[6] 趙士磊，趙玉達(dá)，堯 然，等.小干擾RNA沉默Y盒結(jié)合蛋白-1基因?qū)Ψ蜗侔〢549細(xì)胞株表皮生長(zhǎng)因子受體表達(dá)的影響〔J〕.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2013，30(8)：1595-1597.

[7] 張立英，劉紹霞，趙國(guó)強(qiáng)，等.TNF-α基因siRNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其對(duì)A549細(xì)胞TNF-α和TGF-β1表達(dá)的影響〔J〕.鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2012，47(5)：629-632.

[8] 曹新梅，張岱權(quán)，王 栩，等.靶向HER2基因的siRNA聯(lián)合卡鉑對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞的抑制作用〔J〕.山東醫(yī)藥，2012，52(29)：43-44.

[9] Galluzzo P，Bocchetta M.Notch signaling in lung cancer〔J〕.Expert Rev Anticancer Ther，2011，11(4)：533-540.

[10] 黃 棟，方 芳，許 峰.TLR4-siRNA對(duì)高氧誘導(dǎo)人肺腺癌細(xì)胞株A549炎性因子分泌的影響〔J〕.中華麻醉學(xué)雜志，2012，32(3)：361-363.