李吉河 杜 娟 崔 巖 董文鵬 劉 楓

(大慶油田總醫(yī)院腎內(nèi)科透析室，黑龍江 大慶 163319)

持續(xù)的系膜增殖和系膜基質(zhì)增多可導(dǎo)致不可逆性腎小球硬化〔1〕，抑制系膜細(xì)胞增殖是增殖性腎小球疾病重要的治療策略。S100A4是S100基因家族成員，是一種鈣結(jié)合蛋白〔2〕，參與腎組織內(nèi)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化過(guò)程〔3〕，其對(duì)腎小球系膜細(xì)胞增殖是否有影響尚未見(jiàn)報(bào)告。本研究通過(guò)體外培養(yǎng)大鼠系膜細(xì)胞，探討降低S100A4表達(dá)對(duì)系膜細(xì)胞增殖的調(diào)控作用。

1 材料方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 1640細(xì)胞培養(yǎng)粉劑及Tri201試劑(GIBCO公司)；MicroBCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒、MTT(Sigma公司)；小牛血清(Fetal bovine serum,FCS，Hycolon公司)；羊S100A4抗體、小鼠p21抗體、小鼠cyclinD1抗體、小鼠CDK2抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG、羊抗兔IgG、脂質(zhì)體TransPass R2 Transfection Reagent(Biolab公司)；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen life technologies公司)；PCR試劑 (TaKaRa Biotechnology公司)；ECL顯色試劑盒(Santa Cruz Biotechnology公司)。

1.2大鼠腎小球系膜細(xì)胞系RMC的培養(yǎng) 雄性Wistar大鼠160～200 g由吉林大學(xué)動(dòng)物中心提供。無(wú)菌條件下取雙側(cè)腎臟，剝離腎包膜，腎皮質(zhì)剪成碎塊，放于重疊的三層不銹鋼篩網(wǎng)上。收集第二層篩網(wǎng)上的組織移入離心管，V型膠原酶(0.5 mg/ml)消化，15%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)原代的系膜細(xì)胞，7 d傳代，經(jīng)Desmin(+)、Ⅷ(-)鑒定后，用于以下實(shí)驗(yàn)。

1.3S100A4-15siRNA的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)Genbank中大鼠S100A4-15 mRNA全長(zhǎng)序列(AB020759.1)設(shè)計(jì)抑制siRNA的靶序列：5'-AAGCCTTCTGTTCCTGCTACA-3'，經(jīng)上海吉瑪公司合成雙鏈siRNA(siS100A4)，正義鏈:5'-GCCUUCUGUUCCUGC UACAtt-3'，反義鏈:3'-ttCGGAAGACAAGGACGAUGU-5'。同時(shí)合成無(wú)關(guān)siRNA序列作為對(duì)照(siCon)：正義鏈:5'-UUCUCC GAACGUGUCACGUtt-3'，反義鏈:3'-ttTTAAGAGGCUUGCACA GUGCA-5'。合成的雙鏈siRNA用DEPC處理的水溶解至100 μmol/L，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4siRNA轉(zhuǎn)染 細(xì)胞長(zhǎng)至50%～60%左右(以12孔板為例)，進(jìn)行如下轉(zhuǎn)染步驟(NEB TransPass R2試劑盒)： ①25 μl A液加入0.6 ml無(wú)血清1640培養(yǎng)液中，混勻。②再加入2.5 μl B液體，混勻。③加入終濃度為100 nmol/L的siRNA(siCon或siS100A4)。④室溫靜置孵育20 min。⑤期間待轉(zhuǎn)染細(xì)胞用無(wú)血清1640清洗1遍。⑥孵育液加到細(xì)胞培養(yǎng)皿，37℃培養(yǎng)4 h。⑦細(xì)胞中加1 ml正常RPMI 1640培養(yǎng)液(含血清)。⑧過(guò)夜培養(yǎng)。⑨更換新鮮的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h備用。

1.5細(xì)胞增殖的檢測(cè)

1.5.1MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 大鼠系膜細(xì)胞10 000個(gè)/孔接種于96孔板，無(wú)血清同步16 h后分為以下4組：①無(wú)血清組；②10%FCS正常培養(yǎng)組；③10%FCS+siCon組；④10%FCS+siS100A4組，37℃孵育24～48 h。在到達(dá)各時(shí)間點(diǎn)時(shí)棄去培養(yǎng)液，加入MTT(終濃度5 mg/ml)20 μl，孵育4 h，吸去上清，每孔加入二甲基亞砜(DMSO) 200 μl，室溫溶解15 min，分光光度計(jì)490 nm讀取OD值。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，共重復(fù)3次。

1.5.2流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期 系膜細(xì)胞傳代至25 cm2培養(yǎng)瓶中，無(wú)血清同步16 h后分組同上。培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，PBS液洗2次，加入75%乙醇固定，4℃過(guò)夜，次日離心后PBS液洗2次，重懸于0.5 ml PBS中。樣品經(jīng)RNA酶(50 μg/ml)處理后，碘化丙啶(PI，50 μg/ml)室溫避光染色30 min后上機(jī)。應(yīng)用BD流式細(xì)胞分析儀的FACScan測(cè)量DNA含量，細(xì)胞周期變化數(shù)據(jù)用 CellFIT Cell Cycle Analysis Version 2.0 1.2軟件分析(BD公司)，以細(xì)胞周期各時(shí)相細(xì)胞百分率記錄數(shù)據(jù)并分析。每組3瓶，重復(fù)3次。

1.6Western印跡法檢測(cè)S100A4對(duì)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白p21、cyclin D1、CDK2表達(dá) 系膜細(xì)胞傳代至25 cm2培養(yǎng)瓶中，轉(zhuǎn)染、無(wú)血清同步16 h后分組同上；培養(yǎng)48 h后0.25%胰酶消化收集細(xì)胞。Western印跡法步驟同上：最后分別加入小鼠cyclinD1抗體(1∶100稀釋)、小鼠p21抗體(1∶100稀釋)、小鼠CDK2抗體(1∶100稀釋)、兔β-actin抗體(1∶1 000稀釋)，室溫孵育4 h；TBST洗膜3次，分別加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG(1∶1 000稀釋)、羊抗兔IgG(1∶2 000稀釋)，室溫孵育45 min；TBST洗膜3次；ECL顯影。ALPHAIMAGER 2200凝膠圖像分析系統(tǒng)半定量分析。

2 結(jié) 果

2.1MTT檢測(cè)S100A4對(duì)系膜細(xì)胞增殖速率的影響 轉(zhuǎn)染抑制S100A4的siS100A4后48 h細(xì)胞數(shù)明顯低于正常對(duì)照組和無(wú)關(guān)siRNA(SiCon)組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.2S100A4對(duì)系膜細(xì)胞周期的影響 siRNA抑制S100A4組S期細(xì)胞以及S+G2/M期細(xì)胞數(shù)(增殖指數(shù))明顯低于正常對(duì)照組及無(wú)關(guān)siRNA轉(zhuǎn)染組(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表1 MTT檢測(cè)S100A4對(duì)系膜細(xì)胞增殖速率的影響

表2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期

2.3Western印跡法檢測(cè)周期蛋白CDK2、cyclinD1 和p21的表達(dá)變化 siRNA抑制S100A4 48 h后，細(xì)胞周期蛋白CDK2和CyclinD1均明顯低于正常對(duì)照組及無(wú)關(guān)siRNA轉(zhuǎn)染組(CDK2 10%FCS+siS100A4組:0.61±0.02 vs.10%FCS正常培養(yǎng)組:0.33±0.01；10%FCS+siCon組0.35±0.01P<0.05，n=3，CyclinD1 10%FCS+siS100A4組:0.61±0.02 vs.10%FCS正常培養(yǎng)組:0.51±0.01；10%FCS+siCon組0.46±0.01P<0.05，n=3)；同樣p21(10.45±0.01，P<0.05)也出現(xiàn)類似的變化趨勢(shì)。見(jiàn)圖1。

圖1 Western印跡法檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)

3 討 論

本結(jié)果提示S100A4可能是細(xì)胞增殖的正調(diào)控因子，與其在心肌和平滑肌細(xì)胞的作用研究結(jié)果類似〔3～5〕。細(xì)胞周期的改變必然伴隨著細(xì)胞周期蛋白的變化。在人類增殖性腎炎組織中腎小球內(nèi)E2F1、cyclinD1、CDK2等細(xì)胞周期相關(guān)調(diào)控因子的表達(dá)顯著上調(diào)〔6〕。本研究結(jié)果證實(shí)抑制S100A4可引起促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)程的相關(guān)蛋白CyclinD1和CDK2的表達(dá)水平降低。但抑制細(xì)胞周期進(jìn)程的基因p21卻同樣出現(xiàn)了下調(diào)，該基因的表達(dá)下調(diào)，可能是細(xì)胞周期負(fù)反饋調(diào)節(jié)的代償現(xiàn)象，雖然表達(dá)下調(diào)，但可能不足以抑制促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程的相關(guān)蛋白的作用。

4 參考文獻(xiàn)

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3Fernandez-Fernandez MR，Veprlntsev DB，F(xiàn)ersht AR.Proteins of the S100 family regulate the oligomerization of p53 tumor suppressor〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,2005;102(3)：4735-40.

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